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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 原核表达融合His蛋白，考马斯可见条带，western检测不出啦
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匍匐前进

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达融合His蛋白，考马斯可见条带，western检测不出啦 已有2人参与

用PET20-b,表达his融合蛋白，考马斯亮蓝可以看到表达条带，western检测HIS标签，却杂不出来，有什么指导经验吗
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1楼 2016-12-29 16:14:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
匍匐前进: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-12-30 13:49:03
做过纯化吗？
用镍柱纯化一下再砸
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

pjxiongjing
2楼2016-12-29 16:44:54
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普通回帖

bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
匍匐前进: 金币+5, ★有帮助 2016-12-30 13:49:39
可能是western玩的不6 调整一下抗体浓度 别洗得太狠
转膜效果如何？
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3楼2016-12-29 16:45:47
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流，请尽量一次性回帖 2016-12-30 07:44:38
一般没有条带 问题都出在转膜上
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4楼2016-12-29 16:46:39
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diaomou

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
以一个菜鸟的经验，再做一遍western，可能就有不同的结果了
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5楼2016-12-29 17:18:36
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diaomou

新虫 (小有名气)
对了，western用的是什么显色方法？是用胶片还是在膜上显色？
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6楼2016-12-29 17:19:29
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匍匐前进

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bush119 at 2016-12-29 16:44:54
做过纯化吗？
用镍柱纯化一下再砸

准备做一下试试
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7楼2016-12-29 21:41:24
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匍匐前进

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bush119 at 2016-12-29 16:45:47
可能是western玩的不6 调整一下抗体浓度 别洗得太狠
转膜效果如何？

转膜完全了，转完膜之后的胶考马斯染色看没有条带了，同样的方法表达的另一个相近大小的蛋白western可以检测出来，一张膜，重复两次都是这样
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8楼2016-12-29 21:43:09
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手
引用回帖:
8楼: Originally posted by 匍匐前进 at 2016-12-29 21:43:09
转膜完全了，转完膜之后的胶考马斯染色看没有条带了，同样的方法表达的另一个相近大小的蛋白western可以检测出来，一张膜，重复两次都是这样...

如果你在一张膜上做了平行的一个蛋白 比如32a空载体表达的硫氧还原蛋白（同样带His标签） 同样的His标签可以检测出来 那么问题就来了
首先 我怀疑你这个目的蛋白是否表达
第二 如果表达 你设计的HIs标签是在氨基酸序列的尾部还是中段 还是起始位置
第三 上样电泳之前是否加彻底处理成为一级结构（有比较小的可能His标签包裹在蛋白内部，看His标签位置）
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9楼2016-12-30 14:47:20
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pjxiongjing

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by bush119 at 2016-12-29 16:44:54
做过纯化吗？
用镍柱纯化一下再砸

如果在上清中的表达量低，通过扩大培养后跑wh也不是很强，能否纯化出来，胶图几乎辨别不出目的带，在上清中。

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10楼2017-05-09 21:43:29
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