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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » Ni-NTA亲和层析纯化蛋白的问题（不挂柱！）
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qs8lhy86

新虫 (初入文坛)

[交流] Ni-NTA亲和层析纯化蛋白的问题（不挂柱！）

我的目的蛋白大小在29KDA左右，连接质粒用的是PET28a，双酶切用的是Bam HI 和Hind Ⅲ，诱导表达后发现目的蛋白主要在上清中(图一)，做Ni柱亲和层析用的binding buffer含10mM咪唑，洗脱液分别用 50、100、250mM咪唑，电泳图（图二）显示蛋白并没有洗脱下来，而在最开始的10mM咪唑时似乎就已经洗脱下来了（最右条带）。

问题一:图二的电泳图是否说明我的目的蛋白与Ni柱没有结合上或者结合的很弱？我想的解决办法是把Ni-NTA resin先与蛋白混合，孵育一段时间再上柱，是否可行？

问题二:用PET 28a和Bam HI和Hind Ⅲ双酶切，我的目的蛋白一定会带上HIS标签吗？我担心可能是HIS标签被包埋，根据蛋白的分子量(29KDA)有这种可能吗？我想的解决办法是处理蛋白时binding buffer和elution buffer 都加8M的尿素，但我的是上清不是包涵体，这样是否可行？

问题三:处理蛋白时我加的binding buffer含有10mM咪唑，是否影响目的蛋白与Ni2+ 的结合？

我很困惑，请高人帮我分析原因和建议。感谢！
Ni-NTA亲和层析纯化蛋白的问题（不挂柱！）
图一


Ni-NTA亲和层析纯化蛋白的问题（不挂柱！）-1
图二
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1楼 2016-12-29 10:19:20
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diaomou

新虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-02-08 21:28:20
问题一，应该是没结合。可以试试取一点上清，加一点Ni柱（这样Ni柱占的比例就加大很多），孵育、电泳试试。也可以试试离子交换层析。
问题二，8M的尿素变性蛋白，跟是不是包涵体没关系吧？
问题三，10mM咪唑不影响结合。一般用20mM咪唑洗去杂蛋白。
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2楼2016-12-29 17:15:55
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燕山八字
666

发自小木虫Android客户端
3楼2016-12-29 17:17:00
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qs8lhy86

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by diaomou at 2016-12-29 17:15:55
问题一，应该是没结合。可以试试取一点上清，加一点Ni柱（这样Ni柱占的比例就加大很多），孵育、电泳试试。也可以试试离子交换层析。
问题二，8M的尿素变性蛋白，跟是不是包涵体没关系吧？
问题三，10mM咪唑不影响 ...

binding buffer 里不加咪唑会不会对结合有帮助？

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4楼2016-12-29 21:31:11
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氺泽兮木兰

新虫 (初入文坛)
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应该可以结合一段时间在上柱。如果不是包涵体蛋白，应该没有必要用8M尿素处理吧。初始低浓度咪唑可以用来洗杂蛋白，应该是不会影响目标蛋白的结合的

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5楼2017-02-08 16:46:29
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小树懒很好

新虫 (小有名气)
★
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请问楼主的问题解决了吗？是怎么解决的呢？我的也是挂住效率很低。

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6楼2021-04-19 00:06:52
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