| 查看: 5656 | 回复: 5 | |||
[交流]
Ni-NTA亲和层析纯化蛋白的问题（不挂柱！）
|
|
我的目的蛋白大小在29KDA左右，连接质粒用的是PET28a，双酶切用的是Bam HI 和Hind Ⅲ，诱导表达后发现目的蛋白主要在上清中(图一)，做Ni柱亲和层析用的binding buffer含10mM咪唑，洗脱液分别用 50、100、250mM咪唑，电泳图（图二）显示蛋白并没有洗脱下来，而在最开始的10mM咪唑时似乎就已经洗脱下来了（最右条带）。 问题一:图二的电泳图是否说明我的目的蛋白与Ni柱没有结合上或者结合的很弱？我想的解决办法是把Ni-NTA resin先与蛋白混合，孵育一段时间再上柱，是否可行？ 问题二:用PET 28a和Bam HI和Hind Ⅲ双酶切，我的目的蛋白一定会带上HIS标签吗？我担心可能是HIS标签被包埋，根据蛋白的分子量(29KDA)有这种可能吗？我想的解决办法是处理蛋白时binding buffer和elution buffer 都加8M的尿素，但我的是上清不是包涵体，这样是否可行？ 问题三:处理蛋白时我加的binding buffer含有10mM咪唑，是否影响目的蛋白与Ni2+ 的结合？ 我很困惑，请高人帮我分析原因和建议。感谢！  图一  图二 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有144人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
2楼2016-12-29 17:15:55
|
666 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-12-29 17:17:00
4楼2016-12-29 21:31:11
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
应该可以结合一段时间在上柱。如果不是包涵体蛋白，应该没有必要用8M尿素处理吧。初始低浓度咪唑可以用来洗杂蛋白，应该是不会影响目标蛋白的结合的 发自小木虫Android客户端 |
5楼2017-02-08 16:46:29
6楼2021-04-19 00:06:52
5