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Ni-NTA亲和层析纯化蛋白的问题（不挂柱！）
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我的目的蛋白大小在29KDA左右，连接质粒用的是PET28a，双酶切用的是Bam HI 和Hind Ⅲ，诱导表达后发现目的蛋白主要在上清中(图一)，做Ni柱亲和层析用的binding buffer含10mM咪唑，洗脱液分别用 50、100、250mM咪唑，电泳图（图二）显示蛋白并没有洗脱下来，而在最开始的10mM咪唑时似乎就已经洗脱下来了（最右条带）。 问题一:图二的电泳图是否说明我的目的蛋白与Ni柱没有结合上或者结合的很弱？我想的解决办法是把Ni-NTA resin先与蛋白混合，孵育一段时间再上柱，是否可行？ 问题二:用PET 28a和Bam HI和Hind Ⅲ双酶切，我的目的蛋白一定会带上HIS标签吗？我担心可能是HIS标签被包埋，根据蛋白的分子量(29KDA)有这种可能吗？我想的解决办法是处理蛋白时binding buffer和elution buffer 都加8M的尿素，但我的是上清不是包涵体，这样是否可行？ 问题三:处理蛋白时我加的binding buffer含有10mM咪唑，是否影响目的蛋白与Ni2+ 的结合？ 我很困惑，请高人帮我分析原因和建议。感谢！  图一  图二 |
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