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winter121木虫 (小有名气)
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实时荧光定量-相对定量中内参基因的峰不大正常，求助解决 已有2人参与
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目前的情况是用的仪器ABI 7500 FAST，SYBR做相对定量。做了几板实验，都是目的基因挺好，内参不好。内参基因还有目的基因的引物都是文献中找的。引物合成公司建议降低退火温度跑胶试试，结果，PCR跑胶后一个基因也跑不出来，但是实时荧光定量PCR最起码目的基因的峰很好啊。求大神帮忙分析下原因在哪里。溶解曲线图见附件。 内参0-1.png  1内参的溶解曲线.png  内参基因1.png |
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peitaokong
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【答案】应助回帖
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溶解曲线一般是单峰，代表着引物是特异性扩增。看着Tm值还算正常，在85℃左右。但是有双峰，就代表着非特异扩增。 出现这种情况有三方面原因，一方面是RNA提取过程中乙醇等有机试剂没有晾干，受有机试剂干扰，影响cDNA质量 第二个方面，引物的原因。第三方面，试剂不太好。一般定量的温度是60℃退火，不知道你的设置是多少，还有你用的是什么试剂进行试验的。可以选择改变退火温度，重新设计引物，换更好的试剂。从几个方面看看怎么更好的改善。一般特异性不好，应该增加退火温度而不是降低。 |
2楼2016-12-26 21:13:27
winter121
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winter121
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