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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 请问大家用过fermentas的快切酶么 ？
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卷哥

金虫 (小有名气)

[求助] 请问大家用过fermentas的快切酶么 ？ 已有3人参与

请问大家用过fermentas的快切酶么？就是那个fast digest 酶？我37°C酶切30分钟，用不用终止酶切反应呢？说明书上推荐的是用65° 、10min来终止反应，但此步骤是可选的，大家一般是酶切完直接跑胶还是终止一下酶切反映再跑胶呢？还有就是那个fermentas的双酶切体系要用什么缓冲液怎样找呢？找了官网半天也没见~~~还有就是酶切时用不用在小管里加液体石蜡呢？

再弱弱的问大家一下  ，用无水醋酸钠（分子量82.03）配置3M （pH=5.0）的溶液咋配呢？百度了一下 都是用三水的醋酸钠配的，但是我们实验室只有无水的，我就麻爪了~~~

还有就是问一下大家引物退火 95°C、 5min  ，用不用在小PCR管里加液体石蜡呢？加了石蜡的话，后续试验需用到引物时是不是会有影响呢？
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1楼 2016-12-23 01:10:32
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linglingys

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-28 07:42:10
可以不用终止，酶切完就继续往下做，如果是建库，最好不用快切酶，做一般载体构建快切酶是足够的了

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2楼2016-12-23 08:54:08
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linglingys

新虫 (小有名气)
可以的，只要回收有东西，其实连接要不了多少载体的。一般建库就要求多些

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5楼2016-12-23 09:01:09
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linglingys

新虫 (小有名气)
做PCR现在很少加石蜡油的了

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7楼2016-12-23 09:04:27
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hanzegang

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 卷哥 at 2016-12-23 09:06:19
嗯嗯 我昨天加了 不知道加了会对后续的实验有影响没？我那个小EP管昨天从pcr仪里拿出来时都变形了
...

没影响，EP管变形了是因为管子的质量不行，换进口的吧。
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13楼2016-12-24 10:31:12
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hanzegang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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卷哥: 金币+1 2016-12-27 22:27:01
1.终止不终止，构载体的话影响不大。
2.双酶切体系的buffer应该就在你买的酶的袋子里，你再找好。
3.95度5min钟应该是变性，不是退火。加石蜡油是为了防止温度高，EP管里的PCR体系的液体会挥发，有盖子的话加盖子也可以的。
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14楼2016-12-24 10:34:49
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linglingys

新虫 (小有名气)
引物退火没听说过用到95°C，变性倒是有

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3楼2016-12-23 08:55:51
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卷哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by linglingys at 2016-12-23 08:54:08
可以不用终止，酶切完就继续往下做，如果是建库，最好不用快切酶，做一般载体构建快切酶是足够的了

嗯嗯是的，我就是做载体构建，先用fermentas的快切酶酶切载体，然后进行胶回收。 这样就不用终止反应了是吧？酶切时间到后直接跑胶回收？

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4楼2016-12-23 08:59:34
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卷哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by linglingys at 2016-12-23 08:55:51
引物退火没听说过用到95°C，变性倒是有

嗯嗯 我拿到的实验步骤就是把上下游引物同时加入同一EP管 退火 使之形成双链 我之前不做分子 所以不是太懂

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6楼2016-12-23 09:02:44
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卷哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linglingys at 2016-12-23 09:01:09
可以的，只要回收有东西，其实连接要不了多少载体的。一般建库就要求多些

哦哦 好的 那我今天做的时候就不终止反应 直接用酶切产物跑胶然后回收

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8楼2016-12-23 09:04:40
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卷哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by linglingys at 2016-12-23 09:04:27
做PCR现在很少加石蜡油的了

嗯嗯 我昨天加了 不知道加了会对后续的实验有影响没？我那个小EP管昨天从pcr仪里拿出来时都变形了

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9楼2016-12-23 09:06:19
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linglingys

新虫 (小有名气)
具体什么影响没研究过，管子变形可能是你用管子质量不太好或者放位置不正

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10楼2016-12-23 09:08:46
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