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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 半定量跑不出目的片段 求大神支招
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我叫刘小牛儿

新虫 (初入文坛)

[求助] 半定量跑不出目的片段 求大神支招 已有3人参与

结果如图所示

半定量跑不出目的片段   求大神支招


半定量跑不出目的片段   求大神支招-1


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1楼 2016-12-22 22:18:02
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小蘑菇cc

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-23 07:40:54
你这个程序没有延伸时间就直接终延伸？ 半定量引物最好设到300左右 这样不会跟二聚体混在一起 而且感觉引物特异性不好 扩增出来的很像二聚体 可以重新设计引物试试

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2楼2016-12-23 01:18:04
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xekanek87
祝福
3楼2016-12-23 04:03:27
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我叫刘小牛儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小蘑菇cc at 2016-12-23 01:18:04
你这个程序没有延伸时间就直接终延伸？ 半定量引物最好设到300左右 这样不会跟二聚体混在一起 而且感觉引物特异性不好 扩增出来的很像二聚体 可以重新设计引物试试

有延伸   72度 30s     写的时候忘记了  我想问一下   这个跟模板有关系吗    我的这些引物  之前做过实时荧光定量   不知道为什么做半定量做不出来

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4楼2016-12-23 07:20:28
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你先要确保你的反应程序是正确的，其次你的反应体系，我看着应该是有问题的。反应体系中应该有buffer 镁离子 dNTP这几个东西都是相对固定的，也是保证酶能够发挥作用的，我看你加了5μL的酶，没有dNTP,相当于没有原材料，PCR怎么可能会有东西呢。没有buffer和镁离子，酶的工作环境是没有办法保证的。酶也不能加那么多。希望能够帮到你。
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5楼2016-12-23 08:05:56
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这个体系写得不详细，酶的用量太大了，可以尝试降低下退火温度。
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6楼2016-12-23 09:42:43
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小蘑菇cc

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我叫刘小牛儿 at 2016-12-23 07:20:28
有延伸   72度 30s     写的时候忘记了  我想问一下   这个跟模板有关系吗    我的这些引物  之前做过实时荧光定量   不知道为什么做半定量做不出来
...

我们做半定量引物长度一般是300 定量在100到150之间 如果你怀疑模版的问题可以先用一两个模版和内参引物跑一个程序看看 看大概多少循环达到峰值 内参一般十几二十个循环就可以 如果到二三十才达到峰值肯定就是模版的问题

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7楼2016-12-23 10:19:51
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小蘑菇cc

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 我叫刘小牛儿 at 2016-12-23 07:20:28
有延伸   72度 30s     写的时候忘记了  我想问一下   这个跟模板有关系吗    我的这些引物  之前做过实时荧光定量   不知道为什么做半定量做不出来
...

体系你用的是mix吗 如果是mix问题就不大 还是建议更换引物

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8楼2016-12-23 10:21:33
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wkj5257

新虫 (小有名气)
要不就是cDNA质量不好降解了，一般反转录cDNA放在4度冰箱里最好一个星期内使用，最多两个星期，时间长了要重新反转录。
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分子生物学，未来科技的领导者
9楼2016-12-23 11:13:20
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