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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 构建质粒
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lzhd655

铜虫 (正式写手)

[求助] 构建质粒 已有1人参与

刚开始做RT-PCR，怎样构建功能基因的标线质粒呢？周围的人都是做一次用好长时间，自己也没看过别人怎样弄。求高人说一下主要步骤或者推荐一下资料。
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1楼 2016-12-22 17:57:50
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
lzhd655: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2016-12-25 16:22:10
应该是绝对定量吧。先设计定量的引物探针。第一步，目的基因扩增，用不含探针的一对引物扩增。第二步,扩增的pcr产物跑胶，条带大小正确的话，回收胶。第三步，TA克隆，连接转化。第四步，测序，要求质粒菌液返还。第五步，序列比对 第六步，测序正确的话，返还的质粒测定浓度，根据公式算出拷贝数。第七步，构建标准品，质粒按照拷贝数稀释，一般从十的七次方到十的零次方，这一步一定要精确。第八步，定量PCR上机实验。希望能够帮助你。
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2楼2016-12-22 19:16:25
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