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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SSR条带不清晰
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
从第一张图看，越两边的样品条带清楚，中间的模糊，这显然是电泳的问题。做微卫星我2007年前后，做了四年，我可以负责任的告诉你，你的引物没有问题，PCR可以提高一下退火温度，当然如果知道什么是touch down PCR，用touch down解决会更好。但是PCR优化只是解决上面那些杂带，让你的条带只有目的带，和主题要解决的电泳模糊问题不相干。电泳的问题挺复杂的，我更怀疑点样孔挂胶的问题，但是不知道你的点样孔是不是和以前一样干净。如果不是电泳空的问题，建议换个电泳槽，看起来溶液不像有问题

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

凯瑟
11楼2016-12-25 21:45:37
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夜风嫣然

新虫 (正式写手)
调一下电压，把电压调低一些，跑成弧形电压不稳定，检查下有没有漏液现象，上样品的时候在不溢出的情况下多加一些，还有就是我看你每板胶最上面的胶孔样品条带都很清晰，是不是模板加的太多？你扩pcr的时候是多大微升体系？模板是多少？还有就是染板的时候，显色液多加点甲醛

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12楼2016-12-26 08:46:35
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夜风嫣然

新虫 (正式写手)
还有不要跑太长时间，你这我猜应该超过一个小时了吧？

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13楼2016-12-26 08:48:25
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凯瑟

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 夜风嫣然 at 2016-12-26 08:46:35
调一下电压，把电压调低一些，跑成弧形电压不稳定，检查下有没有漏液现象，上样品的时候在不溢出的情况下多加一些，还有就是我看你每板胶最上面的胶孔样品条带都很清晰，是不是模板加的太多？你扩pcr的时候是多大微 ...

pcr产物是25微升体系的，加了2微升的模板，电压是49v，需要跑一宿才跑完，电压调高，条带就会不直，所以不敢调高电压，加快电泳时间啊

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14楼2016-12-27 23:41:44
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凯瑟

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by yujiaping1 at 2016-12-25 21:45:37
从第一张图看，越两边的样品条带清楚，中间的模糊，这显然是电泳的问题。做微卫星我2007年前后，做了四年，我可以负责任的告诉你，你的引物没有问题，PCR可以提高一下退火温度，当然如果知道什么是touch down PCR， ...

点样孔挂胶，是拔梳子的时候没拔好吗？所有的操作步骤都和以前一样，以前成功的现在就是做不出来，再跑也是跑成下面这样，就是不成功，更奇怪的是以前用过的引物，现在再P，P不出条带，引物重新合成了，还是P不出来，模板没有问题，同一批模板别的引物就可以P出来，但是P出来的，做SSR也做不成功
SSR条带不清晰



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15楼2016-12-27 23:46:09
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凯瑟

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 旷野の风 at 2016-12-24 01:03:33
你好 能把你的聚丙烯酰胺凝胶配方说一下吗？

我用的是试剂盒

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16楼2016-12-27 23:48:19
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夜风嫣然

新虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 凯瑟 at 2016-12-27 23:41:44
pcr产物是25微升体系的，加了2微升的模板，电压是49v，需要跑一宿才跑完，电压调高，条带就会不直，所以不敢调高电压，加快电泳时间啊
...

模板加太多了，你是用什么方法提的DNA？提出来浓度测了吗？浓度是多少？还有电压太低，跑的时间太长肯定条带肯定弥散，你用的是什么电泳仪？

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17楼2016-12-28 08:35:14
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 凯瑟 at 2016-12-27 23:46:09
点样孔挂胶，是拔梳子的时候没拔好吗？所有的操作步骤都和以前一样，以前成功的现在就是做不出来，再跑也是跑成下面这样，就是不成功，更奇怪的是以前用过的引物，现在再P，P不出条带，引物重新合成了，还是P不出来 ...

你这是什么电泳系统，薄厚多少，怎么会50V跑一夜，我们都是160V，180V跑两三个小时，胶厚度1mm，长度大概180*120。你如果只能过夜，效率太低了，我们一次两张版，加染色一天可以跑六张版，引物优化好的大小差距大，可以同一个板跑两个

关于你之前的问题看来不是挂胶的问题，肯定是电泳系统的问题，换了电泳槽，还不好再说吧

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18楼2017-01-02 20:05:41
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lichengpu

新虫 (著名写手)
我觉得是你的DNA略微有降解，如果不是可以换个PCR仪试试。我以前也出现过这样的现象

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19楼2017-01-02 20:41:51
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落璎777

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by yujiaping1 at 2016-12-25 21:45:37
从第一张图看，越两边的样品条带清楚，中间的模糊，这显然是电泳的问题。做微卫星我2007年前后，做了四年，我可以负责任的告诉你，你的引物没有问题，PCR可以提高一下退火温度，当然如果知道什么是touch down PCR， ...

你好，想请教一下聚丙烯酰胺凝胶电泳的配制方法。新手，第一次接触微卫星，请大神指教

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20楼2017-03-15 11:55:53
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