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yujiaping1

木虫 (著名写手)

从第一张图看,越两边的样品条带清楚,中间的模糊,这显然是电泳的问题。做微卫星我2007年前后,做了四年,我可以负责任的告诉你,你的引物没有问题,PCR可以提高一下退火温度,当然如果知道什么是touch down PCR,用touch down解决会更好。但是PCR优化只是解决上面那些杂带,让你的条带只有目的带,和主题要解决的电泳模糊问题不相干。电泳的问题挺复杂的,我更怀疑点样孔挂胶的问题,但是不知道你的点样孔是不是和以前一样干净。如果不是电泳空的问题,建议换个电泳槽,看起来溶液不像有问题

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11楼2016-12-25 21:45:37
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夜风嫣然

新虫 (正式写手)

调一下电压,把电压调低一些,跑成弧形电压不稳定,检查下有没有漏液现象,上样品的时候在不溢出的情况下多加一些,还有就是我看你每板胶最上面的胶孔样品条带都很清晰,是不是模板加的太多?你扩pcr的时候是多大微升体系?模板是多少?还有就是染板的时候,显色液多加点甲醛

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12楼2016-12-26 08:46:35
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夜风嫣然

新虫 (正式写手)

还有不要跑太长时间,你这我猜应该超过一个小时了吧?

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13楼2016-12-26 08:48:25
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凯瑟

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 夜风嫣然 at 2016-12-26 08:46:35
调一下电压,把电压调低一些,跑成弧形电压不稳定,检查下有没有漏液现象,上样品的时候在不溢出的情况下多加一些,还有就是我看你每板胶最上面的胶孔样品条带都很清晰,是不是模板加的太多?你扩pcr的时候是多大微 ...

pcr产物是25微升体系的,加了2微升的模板,电压是49v,需要跑一宿才跑完,电压调高,条带就会不直,所以不敢调高电压,加快电泳时间啊

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14楼2016-12-27 23:41:44
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凯瑟

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by yujiaping1 at 2016-12-25 21:45:37
从第一张图看,越两边的样品条带清楚,中间的模糊,这显然是电泳的问题。做微卫星我2007年前后,做了四年,我可以负责任的告诉你,你的引物没有问题,PCR可以提高一下退火温度,当然如果知道什么是touch down PCR, ...

点样孔挂胶,是拔梳子的时候没拔好吗?所有的操作步骤都和以前一样,以前成功的现在就是做不出来,再跑也是跑成下面这样,就是不成功,更奇怪的是以前用过的引物,现在再P,P不出条带,引物重新合成了,还是P不出来,模板没有问题,同一批模板别的引物就可以P出来,但是P出来的,做SSR也做不成功
SSR条带不清晰



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15楼2016-12-27 23:46:09
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凯瑟

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 旷野の风 at 2016-12-24 01:03:33
你好 能把你的聚丙烯酰胺凝胶配方说一下吗?

我用的是试剂盒

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16楼2016-12-27 23:48:19
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夜风嫣然

新虫 (正式写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 凯瑟 at 2016-12-27 23:41:44
pcr产物是25微升体系的,加了2微升的模板,电压是49v,需要跑一宿才跑完,电压调高,条带就会不直,所以不敢调高电压,加快电泳时间啊
...

模板加太多了,你是用什么方法提的DNA?提出来浓度测了吗?浓度是多少?还有电压太低,跑的时间太长肯定条带肯定弥散,你用的是什么电泳仪?

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17楼2016-12-28 08:35:14
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 凯瑟 at 2016-12-27 23:46:09
点样孔挂胶,是拔梳子的时候没拔好吗?所有的操作步骤都和以前一样,以前成功的现在就是做不出来,再跑也是跑成下面这样,就是不成功,更奇怪的是以前用过的引物,现在再P,P不出条带,引物重新合成了,还是P不出来 ...

你这是什么电泳系统,薄厚多少,怎么会50V跑一夜,我们都是160V,180V跑两三个小时,胶厚度1mm,长度大概180*120。你如果只能过夜,效率太低了,我们一次两张版,加染色一天可以跑六张版,引物优化好的大小差距大,可以同一个板跑两个

关于你之前的问题看来不是挂胶的问题,肯定是电泳系统的问题,换了电泳槽,还不好再说吧

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18楼2017-01-02 20:05:41
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lichengpu

新虫 (著名写手)

我觉得是你的DNA略微有降解,如果不是可以换个PCR仪试试。我以前也出现过这样的现象

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19楼2017-01-02 20:41:51
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落璎777

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
11楼: Originally posted by yujiaping1 at 2016-12-25 21:45:37
从第一张图看,越两边的样品条带清楚,中间的模糊,这显然是电泳的问题。做微卫星我2007年前后,做了四年,我可以负责任的告诉你,你的引物没有问题,PCR可以提高一下退火温度,当然如果知道什么是touch down PCR, ...

你好,想请教一下聚丙烯酰胺凝胶电泳的配制方法。新手,第一次接触微卫星,请大神指教

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20楼2017-03-15 11:55:53
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