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dblydxgl

金虫 (小有名气)

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[交流] PCR 在不同个体中扩增效率不一致

请教关于PCR扩增效率问题，如图，左1-9是不同个体，左10是不加DNA的对照，左11是marker。左7在目标位置稍有痕迹，左9没有目的条带。目标长度分别为80bp,160bp。
      引物是半巢式引物，左右个一条引物，中间的引物和左端的引物预期也可以扩增出条带，所以可以看到两条比较明显的带。
      用的酶是Platinum SuperFi Green PCR Master Mix,
      体系为：mix: 5ul,
                  F1：1ul, R1: 1ul，R2:1ul，终浓度均为0.5uM
                  DNA:1ul
                  超纯水补足10ul
      加样过程是先把出DNA外的mix，引物混好，离心分装后加DNA。
      扩增程序是按照说明书来的，应该问题不大，caculated和block模型都用了，两种程序对两条带的浓度有点影响，但都是有的个体扩得出来，有的扩不出来，图示用的是block模型。
   模版也测过浓度，大致都一样，A260/280比2.0稍高，不超过0.1。这里放的只是10个样品的带，还扩了其他个体，不管DNA浓度和A260/280怎么变，都有扩出来的，也有扩不出来的，大概有3/4的个体可以明显地扩出预期的两条带。我一般会把不同的管按横向一字排开，奇怪的是，扩不出来的基本都是边上的个体。
   现在有三点怀疑：1、PCR仪受热不均匀，但是网上搜了很多也没搜到这样的问题，实验室没有别的PCR仪，又不方便去其他实验室做；2、样品本身引物不同品种之间有差别；3、引物和DNA均是用TE溶解，可能会对扩增有影响。希望各位提提建议，谢谢！

Labuser 2016-12-17 12_11.8_block method_30min.jpg

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1楼 2016-12-19 12:01:24

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引用回帖:

105楼: Originally posted by Ailee桑卡娜 at 2016-12-20 11:07:26
样品浓度有差也不会这么明显，我觉得可能是体系里其他东西的问题。你最浅的那条带不是旁边的，受热不均也有可能。pcr有时候确实会不准的，所以只要有扩出来的就可以不要纠结太多
...

谢谢，做的东西比较特别，最好是所有的样品都有扩增。
之前引物是用TE稀释的，现在换成ddH2O，以前没扩出来的都出来了，说明TE是影响的。但是每个个体扩出来的带还是不整齐，还是感觉PCR仪有点问题。