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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 三个片段通过酶切连接方法连成线性片段
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张小蛋

新虫 (小有名气)

[求助] 三个片段通过酶切连接方法连成线性片段 已有3人参与

有A,B,C三个片段，A片段720bp,含有sac1位点，C片段860bp,含有sal1位点，B片段3500bp两端含有sac1,sal1位点，通过酶切连接方式成线性片段，该怎么连呢？请大家答疑解惑~不胜感激~摩尔浓度比采用多大比较好，实际怎么操作呢？

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1楼 2016-12-15 19:50:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Alice 2016

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张小蛋 at 2016-12-15 21:36:25
这三个片段长度这么长，成功吗，可不可以推荐个用于长片段pcr的酶，谢谢啦
...

推荐用同源重组的方式连接多片段，简直不能太好用。我们实验室用了诺唯赞的一步法克隆试剂盒，真心赞。
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
7楼2016-12-16 09:16:59
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Easygeno重组酶技术
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8楼2016-12-16 16:24:48
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生物狗-哈

新虫 (初入文坛)
同源重组啊，据说诺唯赞的可以做5个片段以内的，不用考虑酶切位点
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12楼2016-12-16 17:22:33
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普通回帖

wuyuanqing

金虫 (正式写手)
overlap pcr

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2楼2016-12-15 20:27:35
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张小蛋

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuyuanqing at 2016-12-15 20:27:35
overlap pcr

这三个片段长度这么长，成功吗，可不可以推荐个用于长片段pcr的酶，谢谢啦

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3楼2016-12-15 21:36:25
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-16 07:39:34
设计引物可进行重叠PCR，酶的话最好用高保真的。

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
4楼2016-12-15 23:37:32
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mochenmi

铜虫 (小有名气)
pcr是最快的，如果一定要用酶切连接，就用一个中间载体吧

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5楼2016-12-16 00:06:21
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张小蛋 at 2016-12-15 21:36:25
这三个片段长度这么长，成功吗，可不可以推荐个用于长片段pcr的酶，谢谢啦
...

全式金的fastpfu或者NEB的Q5

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6楼2016-12-16 00:56:44
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张小蛋

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2016-12-16 16:24:48
Easygeno重组酶技术

嗯嗯，我们确实也在用重组酶，但是这个摩尔浓度比用1.:1:1怎么样？

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9楼2016-12-16 16:34:14
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张小蛋

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Alice 2016 at 2016-12-16 09:16:59
推荐用同源重组的方式连接多片段，简直不能太好用。我们实验室用了诺唯赞的一步法克隆试剂盒，真心赞。...

我们用的也是这个，哈哈，就是我在考虑摩尔浓度比的问题

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10楼2016-12-16 16:34:50
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