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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠延伸PCR扩拼接片段时弥散，怎样解决？
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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)

[求助] 重叠延伸PCR扩拼接片段时弥散，怎样解决？ 已有8人参与

为扩增一个3.8kb的条带，分两段扩，然后拼接，两段都已切胶回收。重叠区181bp，拼接时用过两步法，退火延伸一起72℃3min。38循环
也试过一般的三步。跑出来没有条带，全弥散。求解决办法，谢谢各位大神！！！

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1楼 2016-12-02 09:19:03
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:29:12
你们重叠区这么长181bp，一般你都是这么做的吗？我重叠部分一般都是25-30bp。我没有P过这么长的，181bp那你退火温度是多少啊？
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2楼2016-12-02 14:20:31
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:28:50
其实我一直不太明白，为什么要做重叠PCR，而不做多片段克隆呢？结果都是一样的啊，而且还省了连载体的过程。我上个月才用诺唯赞的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit连过四个片段的，加起来大概8k左右，一次就成功了，楼主可以尝试换个思路试试。希望对你有帮助。
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
3楼2016-12-02 15:36:20
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主
我也在做这个。

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
4楼2016-12-03 09:17:01
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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Alice 2016 at 2016-12-02 15:36:20
其实我一直不太明白，为什么要做重叠PCR，而不做多片段克隆呢？结果都是一样的啊，而且还省了连载体的过程。我上个月才用诺唯赞的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit连过四个片段的，加起来大概8k左右，一次就 ...

当然是想省钱，毕竟我做不了主。

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5楼2016-12-03 09:44:42
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痞子无敌

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只能说……试一下梯度吧…别的也帮不了你了…

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当你当你的眼睛眯着笑
6楼2016-12-03 10:33:59
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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 清嗓金声 at 2016-12-03 09:44:42
当然是想省钱，毕竟我做不了主。
...

你是说同源重组吧？我们有，之前设计引物时没考虑那个，老师也没说，直接做重叠延伸想试一下，不行了再考虑重组。

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7楼2016-12-03 10:43:24
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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 痞子无敌 at 2016-12-03 10:33:59
只能说……试一下梯度吧…别的也帮不了你了…

什么梯度？温度还是模板？

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8楼2016-12-03 10:43:37
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痞子无敌

金虫 (正式写手)
退火温度…就是在退火的时候，用不同的温度，试试看行吗。有的pcr仪可以，有的不可以。也可以叫降落pcr吧…好像，具体请百度…

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当你当你的眼睛眯着笑
9楼2016-12-03 12:04:26
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六维空想

新虫 (小有名气)
重叠区几十bp就差不多了吧

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10楼2016-12-03 15:57:02
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