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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠延伸PCR扩拼接片段时弥散，怎样解决？
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

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设置梯度退火温度，看一下最适合的退火温度

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
11楼2016-12-03 19:02:47
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xuzhangxm

新虫 (初入文坛)
太长了，引物特异性怎么样

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在路上
12楼2016-12-03 19:30:10
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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2016-12-02 14:20:31
你们重叠区这么长181bp，一般你都是这么做的吗？我重叠部分一般都是25-30bp。我没有P过这么长的，181bp那你退火温度是多少啊？

只有一个基因得重叠区这么长，退火温度我按照端的引物，不是按照引物温度？得根据重叠区长度算退火温度？另外一个40多bp就重叠上了。

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13楼2016-12-08 09:27:00
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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-03 19:02:47
设置梯度退火温度，看一下最适合的退火温度

现在属于降低温度提高温度都出不来条带的那种。真怀疑是不是重叠区过长

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14楼2016-12-08 09:28:21
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1334451928

木虫 (小有名气)
减少循环数，30以内；缩短退火时间

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neversaydie！
15楼2016-12-08 09:38:58
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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 1334451928 at 2016-12-08 09:38:58
减少循环数，30以内；缩短退火时间

如果两个片段的中间引物有单引物扩增怎么解决？单引物扩增的原因是什么？

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16楼2016-12-08 09:56:51
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1334451928

木虫 (小有名气)
你是用三个引物做的overlap?

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neversaydie！
17楼2016-12-08 10:45:39
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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 1334451928 at 2016-12-08 10:45:39
你是用三个引物做的overlap?

两个啊，最外端的两个。

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18楼2016-12-08 23:33:47
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

试试两步法PCR，也可以试试提高2个片段的量，同时减少循环次数到10次看看。
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为什么
19楼2016-12-09 00:08:20
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p君少年

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以适当提高退火温度，还有调整片段加入比例
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20楼2016-12-28 14:55:25
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