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清嗓金声

铜虫 (初入文坛)


[求助] 重叠延伸PCR扩拼接片段时弥散,怎样解决? 已有8人参与

为扩增一个3.8kb的条带,分两段扩,然后拼接,两段都已切胶回收。重叠区181bp,拼接时用过两步法,退火延伸一起72℃3min。38循环
也试过一般的三步。跑出来没有条带,全弥散。求解决办法,谢谢各位大神!!!

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痞子无敌

金虫 (正式写手)

退火温度…就是在退火的时候,用不同的温度,试试看行吗。有的pcr仪可以,有的不可以。也可以叫降落pcr吧…好像,具体请百度…

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当你当你的眼睛眯着笑
9楼2016-12-03 12:04:26
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:29:12
你们重叠区这么长181bp,一般你都是这么做的吗?我重叠部分一般都是25-30bp。我没有P过这么长的,181bp那你退火温度是多少啊?
2楼2016-12-02 14:20:31
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:28:50
其实我一直不太明白,为什么要做重叠PCR,而不做多片段克隆呢?结果都是一样的啊,而且还省了连载体的过程。我上个月才用诺唯赞的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit连过四个片段的,加起来大概8k左右,一次就成功了,楼主可以尝试换个思路试试。希望对你有帮助。
怕什么真理无穷,进一寸有一寸的欢喜
3楼2016-12-02 15:36:20
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

知识就像蒲公英的花儿一样,播种在世界的每一个角落。
4楼2016-12-03 09:17:01
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