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安群星

新虫 (初入文坛)

[求助] 一对引物扩增,出现两条带已有5人参与

大家好,小弟最近碰到问题,请大家帮帮忙解决一下。情况是这样的,我用的是Takara的一个载体,在载体上连接了我的目的片段1200bp左右。转化后,用该载体的通用引物扩增,出现了两条带,一条1200bp左右(可能就是我的目的带),一条3000bp左右,且这两条带都很暗。同时,我又用我目的片段的引物扩增,只出现大小相符的目的带。送去测序,引物为目的基因引物时,测序结果与我的目的基因序列相符,证明目的基因是插进去了;但当我用载体的通用引物测序时,就测不出来了。我也尝试胶回收3000bp处的条带链接T载体测序,但由于条带很暗,胶回收后浓度很低,与T载体链接没有成功。请各位大侠帮我分析下。不甚感激
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某某某鸽子

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 安群星 at 2016-12-29 11:55:46
当时挑了两株阳性转化子,都是出现的这种情况,感觉不像是污染,要不然不能刚好都污染了吧,非常谢谢你。...

我想请教一下您当时是怎么解决这个问题的呀,我现在也有同样的问题呢
11楼2020-11-25 22:08:28
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:28:17
污染了,挑菌时挑的不是单菌落,或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因:
通用引物会同时结合两个载体,因此你扩增会出现两条带,测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合你的目标载体,所以只能扩增一条带,测序也能正常测出。
解决方案:
1:现有菌液稀释涂板或平板划线,重新挑取单菌落摇菌培养。
2:若上述方法无法解决,可能是转入多个质粒,重做连接或吧之前做转化的平板拿来重新挑单菌落检测。
2楼2016-11-29 09:05:31
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安群星

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by winyuyuyu123 at 2016-11-29 09:05:31
污染了,挑菌时挑的不是单菌落,或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因:
通用引物会同时结合两个载体,因此你扩增会出现两条带,测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合 ...

首先,非常感谢您的回答。
我后面又新提空载质粒,拿载体的通用引物去扩增,也是扩增出两条带。一条是300bp左右(这个跟空载序列信息符合),一条是进1500bp条带(这条不知道怎么来的),不知道是怎么回事。引物是新用的一管引物,不会有污染。引物是按载体说明书上标注的测序引物序列合成,照理说应该不会特异性不好吧?
3楼2016-12-01 11:50:13
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

会不会是你的引物不特异,把载体上面的片段扩出来了呀,你可以把你的引物拿去NCBI上blast一下
怕什么真理无穷,进一寸有一寸的欢喜
4楼2016-12-02 16:51:45
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