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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 实时荧光PCR绘制标准曲线出现问题
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萧晓1993

银虫 (小有名气)

[求助] 实时荧光PCR绘制标准曲线出现问题 已有1人参与

各位大神，我是使用的AbI7300实时荧光定量PCR仪器进行目的基因的标准曲线绘制，采用SBBR-Green荧光染料，按10倍进行梯度稀释，反反应体系配制：
1、每孔体系                      20µL
primer-F1                    0.4 µL
primer-R1                    0.4 µL
SYBR Green Master（ROX）       12 µL
ddH2O                        7.2 µL
2、PCR 扩增程序：95℃预变性10min；95℃ 10s，60℃ 1min，以此进行 45 个循环；反应结束。
由下面的图感觉很奇怪，就是第一个1：100倍的稀释度的时候，曲线突然往下走了？还有溶解曲线有杂峰，说明是有引物二聚体，应该怎样解决呀？求大神们指教

实时荧光PCR绘制标准曲线出现问题
2016-11-26-1.jpg


实时荧光PCR绘制标准曲线出现问题-1
2016-11-26tm2.jpg@biostar2009
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1楼 2016-11-27 10:52:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

萝卜不困zZ

新虫 (小有名气)
建议先做几个温度梯度，优化一下退火温度。还有操作时尽量避免污染。

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萧晓1993
4楼2016-11-27 19:58:10
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普通回帖

孔名卓

禁虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-11-27 22:22:49
本帖内容被屏蔽
2楼2016-11-27 12:39:27
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萧晓1993

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孔名卓 at 2016-11-27 12:39:27
重新设计引物，上下游引物温度相差不要超过5度，还有特异性片段不要超过200bp，模板纯度注意检测

我的特异性片段没有超过200bp，引物是直接引用的文献里的，上下游引物的温度在5度以内，应该没什么问题吧
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3楼2016-11-27 14:22:31
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山舞银蛇

铁杆木虫 (正式写手)
红色的那条异常曲线，是因为你的模板浓度太高。

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萧晓1993
核酸提取与Taqman诊断
5楼2016-11-27 21:01:21
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萧晓1993

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 萝卜不困zZ at 2016-11-27 19:58:10
建议先做几个温度梯度，优化一下退火温度。还有操作时尽量避免污染。

好的，那我是从60度忘上设置退火温度吗？

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6楼2016-11-27 22:20:56
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萧晓1993

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 山舞银蛇 at 2016-11-27 21:01:21
红色的那条异常曲线，是因为你的模板浓度太高。

好的，谢谢啦。我以后做的时候就从1:1000开始稀释

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7楼2016-11-27 22:22:01
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萝卜不困zZ

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by 萧晓1993 at 2016-11-27 22:20:56
好的，那我是从60度忘上设置退火温度吗？
...

往下吧，哪有那么高的退火温度

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8楼2016-11-27 23:03:13
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孔名卓

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2016-11-27 23:32:36
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许彦

木虫 (正式写手)
基线改为3-6

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10楼2016-11-28 07:47:11
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