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PCR技术及退火温度优化问题 已有6人参与
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最近在扩一个家族的相关基因（植物），扩不出来的基因采用在基因内部设计2个引物分别和两端的引物配对分开扩，得到2个片段后，怎样拼接得到全长？ 有的基因是两个片段扩不出来，可能是表达丰度低。扩增时退火温度怎么优化？我看到一般是Tm值-5度，或者两个引物Tm值平均值-5度。采用先60度5cycles再55度30cycles、先55度5cycles再60度32cycles，和单纯55度38cycles、单纯60度38cycles的区别在哪里，如果采用这四个其中一种程序去扩增扩不出来目的条带，是不是其余三种一般也扩不出来?在Tm相近的一对引物61℃/62℃在55度有非特异条带，但无目的条带，在66度6cycles/60度32cycles扩增则无条带.该怎优化? 实验新手，感觉知识面较窄，有些问题差不多想要的，特来此站求助。扩增基因较多，还得赶进度。感谢大家回答！！！  |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-12-03 22:34:08
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-12-03 22:34:08
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第一个问题，两个前段的拼接需要做重叠pcr. 一般退火温度是引物的Tm值-5,如果出现非特性性扩增且有目的条带，就做切胶回收或者提高退货温度进而提高特异性。你提到的先做几个循环再做30个循环我在重叠pcr中见过，目的是先p出整个模板，再进行整个片段的pcr.对重叠有利。 有非特异性条带无目的条带，首先非特异性条带可能是引物二聚体，无目的条带可能是模板加入太多，导致自身退火（看到小木虫有人说过，我不太确定）可以降低退火温度减少模板量，看是否有目的条带出现， 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-11-22 13:35:01
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