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声线青鸟

新虫 (小有名气)

[交流] 同源臂一直p不出来

最近想删除一个基因,但是,目的基因的上下游同源臂一直p不出来,没有条带。10ul体系有条带,扩增50ul就没有了,为什么呢?在下刚接触分子生物,求各位大神给点建议~

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黄小萌萌

银虫 (小有名气)

★
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优化条件,或者换引物
2楼2016-12-09 20:13:14
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迷路人啊

新虫 (小有名气)

★
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做个温梯,不行的话就换引物,反正是同源臂长一点无所谓
3楼2016-12-10 12:07:06
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原海亮

木虫 (著名写手)

★
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同源臂的大小是多少呢,10微升扩增效果好么?下次pcr的时候,可以做一管10微的为对照,如果10μ可以,50μ不行,那估计是体系大pcr效果不好,你可以都分装成10μ进行扩增。如果都不行,多半是基因组模板降解等原因。如果10μ特异性不好,估计就是引物特异性问题,可以优化pcr条件,或者换引物,祝好!

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
4楼2016-12-10 21:47:48
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笑傲江鱼

新虫 (小有名气)

★
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同源臂我们一直都是50ul体系的,有两个基因的上下臂扩不出来,其他都可以一次搞定

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5楼2016-12-12 13:01:29
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声线青鸟

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 黄小萌萌 at 2016-12-09 20:13:14
优化条件,或者换引物

上下游引物退火温度相差比较大,会不会有影响?

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6楼2016-12-15 12:54:38
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声线青鸟

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-12-10 21:47:48
同源臂的大小是多少呢,10微升扩增效果好么?下次pcr的时候,可以做一管10微的为对照,如果10μ可以,50μ不行,那估计是体系大pcr效果不好,你可以都分装成10μ进行扩增。如果都不行,多半是基因组模板降解等原因。 ...

同源臂大小是2000,会不会太长

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7楼2016-12-15 12:57:28
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黄小萌萌

银虫 (小有名气)

★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by 声线青鸟 at 2016-12-15 07:54:38
上下游引物退火温度相差比较大,会不会有影响?
...

会有影响啊,两者接近,不要差太多

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8楼2016-12-15 14:02:26
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声线青鸟

新虫 (小有名气)

现在只有基因片段下游同源臂有,上游的一直p不出来,各位大神有遇见过这种情况么?

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9楼2016-12-15 14:03:23
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