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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助请教关天PET22B基因翻译问题，我有个基因想插入到PET22B中，关于序列*问题
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fxy0570

金虫 (正式写手)

[求助] 求助请教关天PET22B基因翻译问题，我有个基因想插入到PET22B中，关于序列*问题 已有2人参与

关于 PET22B基因翻译问题，我有个基因想插入到PET22B中，使用NdeI t和XhoI,，我的基因前面的酶切位点是NdeI ，后面是 XhoI，我看PET22B中的NdeI t和XhoI,分别是288和158，这样会不会读反啊，可是设计的时候就是这样设计的？还有直接表达没有ATG我怎么插入目的基因?
之前我做的是使用 PET22B本身的信号肽pelb，发现蛋白分子量变大了，目的蛋白大小为19KD，现有21KD,估计是pelb也一起表达了，现在想pelb是不是要去掉不要使用信号，那么去掉的话目的蛋白没有ATG，那怎么表达呢？
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1楼 2016-11-16 10:36:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小冀-

版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-11-19 22:28:20
双酶切连接在设计引物的时候应该考虑正反的，如果反了而你又没有加自身启动子，那肯定是表达不了的
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···
9楼2016-11-16 22:09:55
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ztt2015

新虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by fxy0570 at 2016-11-16 10:36:39
关于 PET22B基因翻译问题，我有个基因想插入到PET22B中，使用NdeI t和XhoI,，我的基因前面的酶切位点是NdeI ，后面是 XhoI，我看PET22B中的NdeI t和XhoI,分别是288和158，这样会不会读反啊，可是设计的时候就是这样 ...

目标蛋白前加TEV酶酶切位点，蛋白纯化后用酶把前面的切掉就可以了。

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11楼2016-11-19 20:17:44
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
不加信号肽蛋白大部分都在胞内   如果可以不分泌那么直接用pet其他系列载体

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12楼2016-11-20 18:40:56
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WilliamHJ

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by fxy0570 at 2016-11-17 11:13:01
不是这个问题，问题是蛋白上不能有甲硫氨基酸...

你可以用融合表达然后再切掉吧

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学习中
13楼2016-11-22 00:26:21
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普通回帖

a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你看的是反的载体，要看表达先看启动子的方向，再来看怎么插入基因
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fxy0570
2楼2016-11-16 10:48:59
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fxy0570

金虫 (正式写手)
★
送红花一朵
kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-23 20:17:23
引用回帖:
2楼: Originally posted by a13515517892 at 2016-11-16 10:48:59
你看的是反的载体，要看表达先看启动子的方向，再来看怎么插入基因

pet22b载体图谱中标志性序列： T7启动子：361-377 T7转录起始位点：360 pelB信号肽编码序列：224-289 多克隆位点：158-225 His标签编码序列：140-157 T7终止子：26-72 ,意思反相是从361--377往回读的吗？
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3楼2016-11-16 10:58:15
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fxy0570

金虫 (正式写手)
在线等待，有人吗？
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4楼2016-11-16 11:03:06
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fxy0570

金虫 (正式写手)
序列已经明白了，怎么把没有起始密码子的基因插入载体中呢？怎么表达呢？
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5楼2016-11-16 11:16:25
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by fxy0570 at 2016-11-16 11:03:06
在线等待，有人吗？

翻译是顺着启动子往下翻译的，你看看图就知道了

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6楼2016-11-16 11:26:37
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by fxy0570 at 2016-11-16 11:16:25
序列已经明白了，怎么把没有起始密码子的基因插入载体中呢？怎么表达呢？

没有起始密码子就加一个，记得看不要移码咯

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7楼2016-11-16 11:28:02
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fxy0570

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by a13515517892 at 2016-11-16 11:28:02
没有起始密码子就加一个，记得看不要移码咯
...

不能带起始密码子的
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8楼2016-11-16 14:27:43
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fxy0570

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 小冀- at 2016-11-16 22:09:55
双酶切连接在设计引物的时候应该考虑正反的，如果反了而你又没有加自身启动子，那肯定是表达不了的

不是这个问题，问题是蛋白上不能有甲硫氨基酸
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10楼2016-11-17 11:13:01
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