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火麒麟90

铁虫 (初入文坛)

[求助] BAC重组质粒构建问题，电转后不长。

各位大神，我现在在构建BAC基因文库，质粒（8000bp）连接目标片段（20-40kb）,利用T4连接酶将其在16℃连接20h，利用异丙醇和70%的乙醇洗涤两次后除盐，室温下干燥，利用20ul H2O溶解，通过电转导入到EPI300中，但是现在的问题为没有克隆子长出。请问各位大神有什么好的建议和解决方法。谢谢！
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只要自己去努力，没有做不到的事情！
1楼 2016-10-28 09:54:09
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火麒麟90

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 水-水 at 2016-11-23 09:54:41
1）感受态细胞是自己制备的，还是购买的高转化效率的感受态细胞？
2）连接产物，是否载体与片段连接好了？
3）插入片段偏小。

感受态是自己做的，电转质粒还可以。片段和质粒连接没有检查过，不知道怎么查看！

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只要自己去努力，没有做不到的事情！
3楼2016-11-23 16:14:20
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水-水

新虫 (初入文坛)
1）感受态细胞是自己制备的，还是购买的高转化效率的感受态细胞？
2）连接产物，是否载体与片段连接好了？
3）插入片段偏小。
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2楼2016-11-23 09:54:41
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火麒麟90

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 水-水 at 2016-11-23 09:54:41
1）感受态细胞是自己制备的，还是购买的高转化效率的感受态细胞？
2）连接产物，是否载体与片段连接好了？
3）插入片段偏小。

偏小就不行吗，连接不上吗？

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只要自己去努力，没有做不到的事情！
4楼2016-11-23 16:15:06
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水-水

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 火麒麟90 at 2016-11-23 16:15:06
偏小就不行吗，连接不上吗？
...

偏小不易连接。假如只是长得比较少的话，可以挑拣几个，提取质粒酶切验证和测序验证一下。
现在自己构建文库还是比较难，可以考虑选择公司构建。时间周期和成本更低。
武汉拜科基因：http://bacgene.cn/。
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5楼2016-11-29 14:44:37
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