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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体质粒已经被限制酶切开，为什么目的片段还是插不进去？请问有哪些原因和应对策略。
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)

[交流] 载体质粒已经被限制酶切开，为什么目的片段还是插不进去？请问有哪些原因和应对策略。 已有1人参与

如前帖：

在使用相应的限制酶去切载体质粒，琼脂糖凝胶电泳图的条带显示已经被切开。目的片段两端也被处理过，露出对应的黏性末端。目的片段约300bp，载体质粒约4000bp。为什么还是插不进质粒？请问有什么原因以及应对策略？非常感谢！
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1楼 2016-10-28 09:06:47
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kaobo2012

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
钱塘幼麟: 金币+3, 谢谢！ 2016-10-29 15:10:51
目的片段是PCR产物酶切吗？这样有些酶切效果不是很好。可能酶切不了。你可以先连接到T载体上，再酶切目的片段，这样可以保证是酶切完全的。
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3楼2016-10-28 22:46:43
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010308Jing

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
钱塘幼麟: 金币+5, 非常感谢！ 2016-10-29 15:43:15
载体质粒已经被限制酶切开，为什么目的片段还是插不进去？请问有哪些原因和应对策略。

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14楼2016-10-29 15:40:25
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普通回帖

钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
顶
2楼2016-10-28 15:31:13
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
把目的片段的比例提高一下，多加点
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···
4楼2016-10-29 09:06:01
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Rosetta

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
会不会连接时间不够

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5楼2016-10-29 10:20:47
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Rosetta at 2016-10-29 10:20:47
会不会连接时间不够

你好！反应时间都是足够的。

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6楼2016-10-29 11:27:47
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chen5805

至尊木虫 (职业作家)

资深木虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
根据分子运动的理论，目的基因很有可能结合不上去，多做几遍试试

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7楼2016-10-29 13:55:24
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010308Jing

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
钱塘幼麟: 金币+5, 认真负责的解答！ 2016-10-29 15:26:21
引物上加保护碱基了吗？确定你的目的片段也切好露出粘性末端了吗？

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8楼2016-10-29 15:01:47
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-10-28 22:46:43
目的片段是PCR产物酶切吗？这样有些酶切效果不是很好。可能酶切不了。你可以先连接到T载体上，再酶切目的片段，这样可以保证是酶切完全的。

你好！
目的片段是PCR扩增产物。在PCR中，设计的引物将酶切位点引入该片段的两端。请问这样容易酶切吗？
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9楼2016-10-29 15:10:39
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-29 09:06:01
把目的片段的比例提高一下，多加点

你好！
目的片段：载体＝10微升:1微升。请问是否合理？
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10楼2016-10-29 15:11:51
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