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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体质粒已经被限制酶切开，为什么目的片段还是插不进去？请问有哪些原因和应对策略。
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-10-29 15:01:47
引物上加保护碱基了吗？确定你的目的片段也切好露出粘性末端了吗？

你好！
没加保护碱基。但是PCR该目的片段的时候，用引物在片段两端加入了酶切位点。
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11楼2016-10-29 15:14:01
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010308Jing

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切位点是必须加的，但是有一些酶在不加保护碱基的时候是不会识别的，你用的哪种限制性内切酶？

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12楼2016-10-29 15:16:19
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-10-29 15:16:19
酶切位点是必须加的，但是有一些酶在不加保护碱基的时候是不会识别的，你用的哪种限制性内切酶？

使用XmaI这个酶。
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13楼2016-10-29 15:25:57
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010308Jing

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
钱塘幼麟: 金币+5, 非常感谢！ 2016-10-29 15:43:15
载体质粒已经被限制酶切开，为什么目的片段还是插不进去？请问有哪些原因和应对策略。

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14楼2016-10-29 15:40:25
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010308Jing

木虫 (正式写手)
你看看这张图，然后百度内切酶保护碱基，就知道怎么回事儿了

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15楼2016-10-29 15:40:59
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
10楼: Originally posted by 钱塘幼麟 at 2016-10-29 15:11:51
你好！
目的片段：载体＝10微升:1微升。请问是否合理？...

是按摩尔比来算

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···
16楼2016-10-29 18:31:53
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-29 18:31:53
是按摩尔比来算
...

怎样的摩尔比比较合理，请问？

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17楼2016-10-29 18:51:58
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
摩尔比1:5_1:10之间

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···
18楼2016-10-29 18:54:23
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luckydog52

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-10-29 15:40:25

确实可能是保护碱基加的少

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自信源于一次次成功的积累
19楼2016-10-29 21:52:59
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逍遥11
祝福

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20楼2016-10-29 21:59:45
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