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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体质粒已经被限制酶切开，为什么目的片段还是插不进去？请问有哪些原因和应对策略。
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凌波水帘

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
钱塘幼麟: 金币+2, 细心回复！ 2016-11-02 13:36:38
钱塘幼麟: 金币+1, 谢谢！ 2016-11-03 11:58:07
我PCR完后跑胶回收，回收体积不要大，而且，目的片段：载体10：1说的是摩尔数之比，不是体积！除非这两货浓度一样……如果你引物酶切位点加对了的，那考虑提高片段浓度，载体酶切过夜，没看前贴，你可确定是两个酶都切开了，要是还连不上，pcr产物测个序看p的对不对啊

发自小木虫Android客户端
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21楼2016-11-02 01:48:35
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国产武器

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 钱塘幼麟 at 2016-10-29 15:10:39
你好！
目的片段是PCR扩增产物。在PCR中，设计的引物将酶切位点引入该片段的两端。请问这样容易酶切吗？...

有保护碱基还是很容易的，省去连T的时间

发自小木虫Android客户端
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22楼2016-11-02 08:10:26
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可爱范儿二

铜虫 (小有名气)
乙醇没吹干净？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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23楼2016-11-02 09:16:47
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hjyxm

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
钱塘幼麟: 金币+3, 谢谢！ 2016-11-02 13:35:52
钱塘幼麟: 金币+1, 谢谢！ 2016-11-03 11:57:55
最好是设计引物的时候在5·端加入限制性内切酶的碱基，然后连接到T载体上，测序后，再酶切连接，效果更好！
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好好工作！
24楼2016-11-02 11:23:57
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by hjyxm at 2016-11-02 11:23:57
最好是设计引物的时候在5·端加入限制性内切酶的碱基，然后连接到T载体上，测序后，再酶切连接，效果更好！

你好！
能不能麻烦说一下具体操作细节或者给个protocol！谢谢！
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25楼2016-11-02 13:35:42
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zhaoxik

金虫 (正式写手)

Dr.
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
目标片段数量是否合理？
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黄沙百战穿金甲，不破楼兰终不还。
26楼2016-11-02 16:44:45
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hattie919822

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by 钱塘幼麟 at 2016-10-29 15:11:51
你好！
目的片段：载体＝10微升:1微升。请问是否合理？...

可以适当再提高一些比例
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不见不知不伴不惜不
27楼2016-11-18 17:06:42
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