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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
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在线: 83.3小时
虫号: 3096694
注册: 2014-03-28
性别: GG
专业: 微生物资源与分类学

[求助] 请问SDS-PAGE每次都跑成这样是时间太长还是不够啊？已有1人参与

基本每次跑都跑成这样，我的目的蛋白大小比较小，有一个甚至是10kD以下的
请问看这图的话是跑过头了还是跑得还不够啊？

这次是80V跑了1h，然后改成100V跑了2h零5min的

以前跑过40min+1h40min的也几乎是这样
是应该再跑一段时间还是提前一些呢？

而且现在跑的条带特别模糊，是因为跑得时候发热太严重吗？
我试过一次恒流跑，30mA跑了三个多小时才跑到中间···

如何能跑出别人那种条带清晰分明，并且低分子量也很清晰的条带呢？

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1楼 2016-10-26 16:57:49

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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

应助: 21 (小学生)
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红花: 2
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虫号: 4912791
注册: 2016-08-12
专业: 病原真菌学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kuaile5420: 金币+3, 欢迎发帖交流 2016-10-27 20:54:39

楼主，看了你的电泳图，我有几个建议：
1.关于条带不直有拖尾，可能是凝胶不均匀，也可能是蛋白有降解。建议配胶前，洗净夹板晾干；配胶时充分混匀再灌胶。制备样品时加入少许PMSF和DTT，样品的预处理，加入5X SDS-Loading后沸水煮10min，再上样。
2.关于条带宽度不一，是因为你的上样量不均一。建议在蛋白样品制备后，做一个BCA定量，一个小时就搞定，然后取等量的蛋白样品（如10μg），用1X SDS-Loading补齐至等体积上样电泳。
3.关于最左侧条带弯曲，是电泳时的边沿效应导致。建议是用等体积的1X SDS Loading加入到空的点样孔进行平衡。
4.关于凝胶大小及底部皱缩。浓度越大的凝胶，塑性越强，但是也容易因干燥而卷曲皱缩。因此在拍照前及拍照时，要保持凝胶湿润，可往上浇洒少许电泳液。
5.关于蛋白分子量，不同浓度的凝胶分辨率不一，Takara说明书上写的很详细，15-40kd用12%的gel，20kd以下用15%gel。
6.楼主这个电泳图不知是否有Marker，因此实在看不出10kd条带应该在哪。建议楼主买个预染的Marker，电泳时就可分辨不同大小条带位置，从而调整最适电泳时间。至于Marker规格，根据你自己的蛋白大小去选择。
以上