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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕业实验，转化涂布不长菌求分析
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zeyuanzi

新虫 (小有名气)

[求助] 毕业实验，转化涂布不长菌求分析 已有4人参与

调整了一下卡那浓度，未切质粒长出菌了，但重组质粒想不出来。求指导分析一下，都有什么原因？未酶切的质粒长菌至少说明我的感受态没问题，有导进去。也说明我的未切质粒正常。那是什么原因导致我的重组质粒长不出菌？
dna和质粒的比例？质粒的酶切回收，去磷酸化没做好？还是连接出了错？

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1楼 2016-10-21 14:28:27
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zeyuanzi

新虫 (小有名气)
救救我的实验

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2楼2016-10-21 14:42:58
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star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以提供相应的技术服务

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3楼2016-10-21 15:37:45
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D_gz

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-22 21:58:51
我刚开始做连接也是这样，最可能的原因是连接不成功，载体和插入片段比例会有影响，一般1:3到1:5就行。我想问你，载体质粒酶切回收和目的基因酶切回收的核酸电泳浓度如何？这个很关键。
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不做怎么知道。
4楼2016-10-21 16:23:19
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zeyuanzi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by D_gz at 2016-10-21 16:23:19
我刚开始做连接也是这样，最可能的原因是连接不成功，载体和插入片段比例会有影响，一般1:3到1:5就行。我想问你，载体质粒酶切回收和目的基因酶切回收的核酸电泳浓度如何？这个很关键。

质粒还好，回收dna差点，老师说也可以用。我的比例算出来接近1:5,我加1ul质粒，9ul dna

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5楼2016-10-21 17:02:31
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zeyuanzi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by star013 at 2016-10-21 15:37:45
我们公司可以提供相应的技术服务

我也想，但学生做毕业实验没有经费

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6楼2016-10-21 17:03:25
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D_gz

铜虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-25 22:16:48
引用回帖:
5楼: Originally posted by zeyuanzi at 2016-10-21 17:02:31
质粒还好，回收dna差点，老师说也可以用。我的比例算出来接近1:5,我加1ul质粒，9ul dna
...

DNA片段是连了T载体后酶切还是直接PCR产物酶切？PCR产物酶切的话效率比较低，如果是连T载体后酶切OK的话，就要考虑是不是转化的问题了。
未切质粒转化效率一般很高，连接产物转化效率就不好说了。
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不做怎么知道。
7楼2016-10-21 17:13:26
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zeyuanzi

新虫 (小有名气)
前者，感谢回答。原因确实很难找到

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8楼2016-10-21 17:32:22
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
极有可能是没连上，重新连试试吧吧
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···
9楼2016-10-22 20:47:55
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-25 22:17:14
一般是实验要不要去磷酸化都没什么关系。要么是比例问题，要么是感受态问题。pmol比例1：3-1：10都试试。如果不行，买感受态来转化。质粒还是跑个胶看看从胶上看不看得出来。

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10楼2016-10-23 08:30:45
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