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mjl3680木虫 (小有名气)
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求助PCR问题
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我用一段长约1900bp的已知序列做模板,设计两个引物互补长度约为12-13个bp,两端设计了酶切位点,可就是P不出来,基本上没有任何条带，退火温度从50-58都做了,本来认为这步很简单,不知道是引物出现问题吗?谁能帮我看看,引物1改变了两个碱基,是怕形成二聚体,我这问题在哪啊,帮帮我吧 引物1: 5'-3' gcgcggatccATGGAGTTATTA 上游引物 正链5' BamH I Tm 63.9 引物2: 5'-3' gccggccgTATTTCTTCTTGA 下游引物 正链3' Sac I Tm 64.1 要扩的序列gcgcggatccATGGAGTTATTA AATAGTTATAATTTTGTTTTATTCGTATTAACTCAAATGATATTAATGTT TACAATACCAGCTATAATTAGTGGTATTAAGTACAGTAAACTTGATTATT TTTTCATTATAGGAATTTCGACATTATCGTTATTTCTATTTAAAATGTTT GATAGCGCGTCCTTAATCATTTTAACTTCATTCATTATTATAATGTATTT TGTCAAAATCAAATGGTATTCTATTTTGTTGATTATGACTTCACAGATTA TTCTGTACTGTGCTAACTACATGTATATTGTTATATATGCATATATCACC AAGATTTCTGATAGTATATTTGTAATATTCCCTAGCTTTTTTGTAGTTTA TGTGACTATTAGTATACTATTCTCATATATAATAAATAGAGTTCTCAAAA AAATTAGCACACCATATCTAATACTAAACAAAGGATTTTTAATAGTTATT TCGACTATCTTACTGCTTACTTTTTCATTATTTTTCTTTTATTCACAAAT AAACTCGGATGAAGCTAAAGTAATAAGGCAGTATTCTTTTATTTTTATTG GTATCACTATATTTTTAAGTATATTAACATTTGTTATTTCTCAA TTTCTC CTTAAAGAGATGAAATATAAACGTAATCAAGAAGAAATTgccggccg [ Last edited by 350784478 on 2009-11-5 at 14:51 ] |
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2楼2008-11-26 17:52:56
wangjiasi
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3楼2008-11-26 18:08:22
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5楼2008-11-26 18:17:23
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楼主给的基因是原始的模板吗，有歧议吧 如果是模板那没什么说的，怎么退火也该出东西 从楼主描述，理解你给的是P后的产物，如果是这样的话，引物按你说的只有12-13的互补，楼主的问题在于，BamH I Tm 63.9， Sac I Tm 64.1这个数值不代表第一次退火引物与基因互补区的结合温度，你的互补区温度很低 如果是这样，第一轮退火不降到15度以下，恐怕怎么也P不出来，因为如二楼说的，Tm值太低了， 如果不重新设计引物，想试一试的话 不妨头二轮退火温度设成15度左右，以后退火正常为50-55度 （注：只是凭感觉认为勉强值得一试，如果这样都没有东西那就重新设计吧， 粗略设计一下如下， GCGCGGATCCATGGAGTTATTAAATAGTTATAATTTTG GAGATGAAATATAAACGTAATCAAGAAGAAATTGCCGGC） 祝你实验顺利，如果做了把结果拿来跟大家分享 欢迎继续交流 [ Last edited by chysx6 on 2008-11-26 at 19:27 ] |
6楼2008-11-26 19:25:08
mjl3680
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7楼2008-12-01 15:01:23