| 查看: 572 | 回复: 6 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
mjl3680木虫 (小有名气)
|
[交流]
求助PCR问题
|
||
|
我用一段长约1900bp的已知序列做模板,设计两个引物互补长度约为12-13个bp,两端设计了酶切位点,可就是P不出来,基本上没有任何条带，退火温度从50-58都做了,本来认为这步很简单,不知道是引物出现问题吗?谁能帮我看看,引物1改变了两个碱基,是怕形成二聚体,我这问题在哪啊,帮帮我吧 引物1: 5'-3' gcgcggatccATGGAGTTATTA 上游引物 正链5' BamH I Tm 63.9 引物2: 5'-3' gccggccgTATTTCTTCTTGA 下游引物 正链3' Sac I Tm 64.1 要扩的序列gcgcggatccATGGAGTTATTA AATAGTTATAATTTTGTTTTATTCGTATTAACTCAAATGATATTAATGTT TACAATACCAGCTATAATTAGTGGTATTAAGTACAGTAAACTTGATTATT TTTTCATTATAGGAATTTCGACATTATCGTTATTTCTATTTAAAATGTTT GATAGCGCGTCCTTAATCATTTTAACTTCATTCATTATTATAATGTATTT TGTCAAAATCAAATGGTATTCTATTTTGTTGATTATGACTTCACAGATTA TTCTGTACTGTGCTAACTACATGTATATTGTTATATATGCATATATCACC AAGATTTCTGATAGTATATTTGTAATATTCCCTAGCTTTTTTGTAGTTTA TGTGACTATTAGTATACTATTCTCATATATAATAAATAGAGTTCTCAAAA AAATTAGCACACCATATCTAATACTAAACAAAGGATTTTTAATAGTTATT TCGACTATCTTACTGCTTACTTTTTCATTATTTTTCTTTTATTCACAAAT AAACTCGGATGAAGCTAAAGTAATAAGGCAGTATTCTTTTATTTTTATTG GTATCACTATATTTTTAAGTATATTAACATTTGTTATTTCTCAA TTTCTC CTTAAAGAGATGAAATATAAACGTAATCAAGAAGAAATTgccggccg [ Last edited by 350784478 on 2009-11-5 at 14:51 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
压国家一区线，求导师收留，有恩必谢！
已经有4人回复
-
081200-314
已经有4人回复
-
289求调剂
已经有9人回复
-
085405 考的11408求各位老师带走
已经有3人回复
-
339求调剂
已经有6人回复
-
材料与化工272求调剂
已经有4人回复
-
085701环境工程，267求调剂
已经有15人回复
-
材料求调剂一志愿哈工大324
已经有9人回复
-
292求调剂
已经有15人回复
-
304求调剂
已经有5人回复
★ ★ ★ ★ ★
司马诸葛(金币+5,VIP+0):lz奖励 8-16 16:05
司马诸葛(金币+5,VIP+0):lz奖励 8-16 16:05
|
楼主给的基因是原始的模板吗，有歧议吧 如果是模板那没什么说的，怎么退火也该出东西 从楼主描述，理解你给的是P后的产物，如果是这样的话，引物按你说的只有12-13的互补，楼主的问题在于，BamH I Tm 63.9， Sac I Tm 64.1这个数值不代表第一次退火引物与基因互补区的结合温度，你的互补区温度很低 如果是这样，第一轮退火不降到15度以下，恐怕怎么也P不出来，因为如二楼说的，Tm值太低了， 如果不重新设计引物，想试一试的话 不妨头二轮退火温度设成15度左右，以后退火正常为50-55度 （注：只是凭感觉认为勉强值得一试，如果这样都没有东西那就重新设计吧， 粗略设计一下如下， GCGCGGATCCATGGAGTTATTAAATAGTTATAATTTTG GAGATGAAATATAAACGTAATCAAGAAGAAATTGCCGGC） 祝你实验顺利，如果做了把结果拿来跟大家分享 欢迎继续交流 [ Last edited by chysx6 on 2008-11-26 at 19:27 ] |
6楼2008-11-26 19:25:08
2楼2008-11-26 17:52:56
wangjiasi
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2382.9
- 散金: 120
- 红花: 4
- 帖子: 346
- 在线: 737.9小时
- 虫号: 450308
- 注册: 2007-11-04
- 性别: GG
- 专业: 生化分析及生物传感
3楼2008-11-26 18:08:22
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
- BioEPI: 3
- 应助: 1 (幼儿园)
- 贵宾: 0.021
- 金币: 7298.5
- 散金: 9
- 红花: 13
- 帖子: 4032
- 在线: 224.7小时
- 虫号: 551611
- 注册: 2008-04-27
- 性别: GG
- 专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受
4楼2008-11-26 18:10:00
20