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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接转化不长菌
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阿静

金虫 (正式写手)
连接是有mol比的

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又将踏入新的旅程
61楼2016-10-20 02:03:19
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hattie919822

银虫 (初入文坛)
重组质粒那一块可以从以下几个方面分析：酶切之后电泳酶切后的载体 看看是否被切开 验证内切酶活性 切开后的质粒是线性的 跑的会比超螺旋得慢 2，目的基因PCR回收纯化3，载体酶切之后去磷酸化再连接，4转化的时候做一个对照 就是未酶切的载体转化

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不见不知不伴不惜不
62楼2016-10-20 12:05:25
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以做技术服务哈

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63楼2016-10-20 12:48:10
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feierorange

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

3.加卡那未酶切质粒的感受态—不长 如果你确定你的原始质粒和酶切连接后质粒抗性是一样的  那问题就可能不是酶切回收连接造成的 因为你转质粒也不成功啊 你抗生素的浓度没问题吧 你用的转化方法正确吗
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64楼2016-10-20 15:24:43
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zeyuanzi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
64楼: Originally posted by feierorange at 2016-10-20 15:24:43
3.加卡那未酶切质粒的感受态—不长 如果你确定你的原始质粒和酶切连接后质粒抗性是一样的  那问题就可能不是酶切回收连接造成的 因为你转质粒也不成功啊 你抗生素的浓度没问题吧 你用的转化方法正确吗

抗生素是卡那，加的浓度不大清楚。我配好50mg/ml，平板是20ml，那我是加原液20ul构成1mg就可以，还是稀释卡那1:1000再取200ul？

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65楼2016-10-20 15:46:31
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feierorange

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
65楼: Originally posted by zeyuanzi at 2016-10-20 15:46:31
抗生素是卡那，加的浓度不大清楚。我配好50mg/ml，平板是20ml，那我是加原液20ul构成1mg就可以，还是稀释卡那1:1000再取200ul？
...

浓度应该没有问题 我们的使用浓度也是50ug/ml
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66楼2016-10-20 16:37:10
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Demon黄

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我想问一下，你的那个加卡那是热休克后培养的时候用的是含卡那的LB吗。如果是的话，菌是不会长的。热休克后，应加入不含抗性的培养基进行培养，这样是让细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。还有要说明的是，感受态细菌本生是没有质粒的
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67楼2016-10-20 17:23:08
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zeyuanzi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
67楼: Originally posted by Demon黄 at 2016-10-20 17:23:08
我想问一下，你的那个加卡那是热休克后培养的时候用的是含卡那的LB吗。如果是的话，菌是不会长的。热休克后，应加入不含抗性的培养基进行培养，这样是让细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。还有 ...

没加卡那

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68楼2016-10-20 19:29:09
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子

【答案】应助回帖

确定质粒没有问题的话，未酶切的质粒 感受态正常的话  热转一般 效率会非常高 。

首先确定质粒没有问题，其次更换感受态。

自己懒得做的话  购买公司的就是
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麻辣王子不爱做实验
69楼2016-10-20 20:48:07
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lemonvivi

新虫 (小有名气)
最后一个质粒有没切吗

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70楼2016-10-20 20:51:10
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