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皮蛋同学新虫 (小有名气)
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[求助]
连接-滚环扩增做了两个月只做出来一次，求大神指导！ 已有2人参与
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最近在做连接-滚环扩增，做了两个月了，只做出来了一次。实验菜鸟求大神指导T-T 20ul 连接体系：10uM 锁式探针 4ul，10uM 目标物 2ul，10Xbuffer 2ul，T4连接酶 4U。 PCR仪 22度 1h，65度灭活10min。 10ul 连接产物加入 10ul 外切酶混合物，37度孵箱孵育 1h，水浴85度灭活 15min。 20ul 酶切产物加入引物4 ul（200nM）,Bst 酶 16U, buffer 4ul,dNTP 3.2ul, 水6.8ul， 水浴65度 2h 所有序列都是公司合成的，实验期间换过序列，换过酶，换过温度和时间，都做不出来。直到最近才做出来过一次，电泳出来有阶梯状条带，肉眼没有絮状物。（听师姐说他们做的滚环扩增都会出现肉眼可见絮状物，效果好的半小时就能出现）但之后又做过几次，酶切后和扩增后的样本电泳均没有任何条带。 现在有几个问题，一是请各位大神看看我的实验方法有没有错误，二是请问滚环扩增都能出现肉眼可见的絮状物吗？三是如果酶切后无电泳条带，是不是就意味着连接失败（理论上成环后应该是不能被酶切的）。实验拖了两三个月了，跪求大神指导T-T |
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