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nandaxq

铜虫 (小有名气)

[交流] 求助,有效去除引物二聚体的方法。谢谢!

本人,因要做荧光定量PCR,对引物的特异性要求很高,二聚体都没有最好,

现在所P条带,除目的带外,还具有比较明显的二聚体(导致Real-Time时出现

2个峰),请教各位大侠,如何在现有引物条件下,减少甚至去除二聚体?

谢谢指教!
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lipishun

金虫 (小有名气)

你设计的引物很特异?
提高退火温度,或者直接用两步法
2楼2008-11-26 00:06:41
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nandaxq

铜虫 (小有名气)

是的,只有一条带,但二聚体明显,温度已由55提到了57,还是没有什么改善,

请问两步法是何意?能否讲详细点,谢谢。
引诱若够,女人无所谓正派;筹码若高,男人无所谓忠诚;骑着白马的唐僧;带着翅膀的鸟人。
3楼2008-11-26 11:24:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


nandaxq(金币+1,VIP+0):这个估计很难啊,57要跳到72行不通的吧。
就是退火和延伸用同个温度,就是说,退火温度要很高
试试热启动酶,能够很大程度上消除dimer的
4楼2008-11-26 16:35:14
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tuotuozw

银虫 (小有名气)

加最少的引物就可以了
5楼2008-11-27 08:41:47
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taishuai2004

其实 这些办法的作用都很小 主要还是在引物设计上  多设计几对引物试一试
6楼2008-11-27 08:51:43
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nandaxq

铜虫 (小有名气)

我都设了好多引物啦,上游5条,下游5条呢,。结果还是没有满意的啊
引诱若够,女人无所谓正派;筹码若高,男人无所谓忠诚;骑着白马的唐僧;带着翅膀的鸟人。
7楼2008-11-27 21:35:29
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shining-rose

金虫 (小有名气)


nandaxq(金币+1,VIP+0):谢谢
不要着急。
1.选用好一些的酶。
2.多设计几对引物,相互比较(不要用同一软件设计)
3.提高退火温度(建议做一个退火温度的梯度,记得做对照哦)
4.实在不行,还是可以做荧光pcr的,影响应该不大,你的目的片段多大?
8楼2008-11-28 14:48:26
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nandaxq

铜虫 (小有名气)

谢谢各位,fighting
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9楼2008-11-28 17:00:32
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tiny1979

金虫 (小有名气)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢提供帮助~~
还有一个办法也许可以试试,加入上下游引物的量不按1:1加入,可按1/2或1/3的比例,当然前提在引物已不能重新选择设计。这是一家专门做荧光定量PCR公司的技术支持人员提供的经验。
我个人的体会是可把引物浓度降低,这样二聚体也会少。
10楼2008-11-28 17:13:14
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