应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 毕赤酵母GS115表达抗菌肽
131/2返回列表12下一页
查看: 2302  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

么么哒0120

铜虫 (小有名气)

[交流] 毕赤酵母GS115表达抗菌肽

最近做毕赤酵母表达遇到了问题，请各位大侠帮忙解答一下，感激不尽！！！

具体情况：目的基因重组到载体pPICZaA上，测序是正确的，SacI单酶切线性化，转化到GS115中，YPD（Z+）筛选，转化效率还挺高的，挑单克隆PCR验证后都是阳性，下面的是做表达。

表达的条件：BMGY/BMMY，pH=6，28℃，甲醇诱导，浓度为0.5%，诱导4天，每隔一天补加0.5%的甲醇。诱导结束收集上清，用3KD超滤管超滤（我的目的多肽比较小，超滤是去除一些大的蛋白，所以超滤完要的是下层超滤液），取下层超滤液做抑菌检测。

问题：之前挑的每一个阳性克隆都有抑菌活性，可是最近发酵了几次都没有抑菌活性了，-80℃保存的甘油菌拿出来活化再做诱导，也没有抑菌活性，载体拿去测序也没有问题，划线到YPD（Z+）平板，菌株都能正常生长，再次用PCR检测也能扩增到目的条带，难道是我的菌株不稳定吗？怎么突然就不表达了？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-09-20 11:36:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kang139com

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做过是因为发酵后培养基的pH很低，牛津杯法，指示菌为枯草芽孢杆菌都有抑菌圈，因为做了对照，发现是这个原因

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2016-09-20 11:42:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

么么哒0120

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kang139com at 2016-09-20 11:42:39
我做过是因为发酵后培养基的pH很低，牛津杯法，指示菌为枯草芽孢杆菌都有抑菌圈，因为做了对照，发现是这个原因

你用的什么培养基？我的是BMMY，里面有磷酸钾缓冲液，pH基本都在6左右。你也是小瓶诱导吗？什么条件?
赞一下 回复此楼
3楼2016-09-20 12:16:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kang139com

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
么么哒0120: 金币+2 2016-09-26 14:07:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-09-20 12:16:02
你用的什么培养基？我的是BMMY，里面有磷酸钾缓冲液，pH基本都在6左右。你也是小瓶诱导吗？什么条件?...

做的是组成型表达的，用的是YPD，补加碳源和氮源，pH到了2点多～
然后后续做诱导的，培养基就是BMMY，pH也到了4到5左右～就怕对只是菌也有影响～

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2016-09-21 09:10:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

么么哒0120

铜虫 (小有名气)
为什么回复的人这么少，真心求指点！
赞一下 回复此楼
5楼2016-09-23 14:41:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

么么哒0120

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kang139com at 2016-09-21 09:10:09
做的是组成型表达的，用的是YPD，补加碳源和氮源，pH到了2点多～
然后后续做诱导的，培养基就是BMMY，pH也到了4到5左右～就怕对只是菌也有影响～
...

你现在已经做出来啦？你的蛋白多大？
赞一下 回复此楼
6楼2016-09-23 14:45:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kungfu2016

新虫 (正式写手)
可能菌不稳定

发自小木虫Android客户端
回复此楼
7楼2016-09-23 18:48:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kang139com

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 么么哒0120 at 2016-09-23 14:45:42
你现在已经做出来啦？你的蛋白多大？...

没有

发自小木虫Android客户端
回复此楼
8楼2016-09-23 21:23:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

烟雨莫问

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
么么哒0120: 金币+1 2016-09-26 14:07:38
一般筛选用MD平板，酵母表达手册好像是1%/24h甲醇诱导，酵母表达存在翻译后修饰，有可能会影响活性。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
9楼2016-09-26 00:39:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

么么哒0120

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by kungfu2016 at 2016-09-23 18:48:33
可能菌不稳定

如果真的是菌不稳定，用什么方法能解决呢？
赞一下 回复此楼
10楼2016-09-26 08:38:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 么么哒0120 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +8 Tide man 2026-08-10 9/450 2026-08-11 20:39 by beefly
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +3 majunge000 2026-08-11 4/200 2026-08-11 20:13 by lch2012
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +3 布布和一二 2026-08-11 4/200 2026-08-11 15:20 by aasahr
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 13/650 2026-08-11 09:49 by 家与远方
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 好奇怪的filecode +4 布布和一二 2026-08-08 5/250 2026-08-10 14:20 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭