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毕赤酵母GS115表达抗菌肽
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最近做毕赤酵母表达遇到了问题，请各位大侠帮忙解答一下，感激不尽！！！ 具体情况：目的基因重组到载体pPICZaA上，测序是正确的，SacI单酶切线性化，转化到GS115中，YPD（Z+）筛选，转化效率还挺高的，挑单克隆PCR验证后都是阳性，下面的是做表达。 表达的条件：BMGY/BMMY，pH=6，28℃，甲醇诱导，浓度为0.5%，诱导4天，每隔一天补加0.5%的甲醇。诱导结束收集上清，用3KD超滤管超滤（我的目的多肽比较小，超滤是去除一些大的蛋白，所以超滤完要的是下层超滤液），取下层超滤液做抑菌检测。 问题：之前挑的每一个阳性克隆都有抑菌活性，可是最近发酵了几次都没有抑菌活性了，-80℃保存的甘油菌拿出来活化再做诱导，也没有抑菌活性，载体拿去测序也没有问题，划线到YPD（Z+）平板，菌株都能正常生长，再次用PCR检测也能扩增到目的条带，难道是我的菌株不稳定吗？怎么突然就不表达了？ |
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3楼2016-09-20 12:16:02
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
么么哒0120: 金币+2 2016-09-26 14:07:58
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么么哒0120: 金币+2 2016-09-26 14:07:58
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做的是组成型表达的，用的是YPD，补加碳源和氮源，pH到了2点多～ 然后后续做诱导的，培养基就是BMMY，pH也到了4到5左右～就怕对只是菌也有影响～ 发自小木虫Android客户端 |
4楼2016-09-21 09:10:09
5楼2016-09-23 14:41:55
6楼2016-09-23 14:45:42
kungfu2016
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7楼2016-09-23 18:48:33
8楼2016-09-23 21:23:17
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么么哒0120: 金币+1 2016-09-26 14:07:38
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么么哒0120: 金币+1 2016-09-26 14:07:38
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一般筛选用MD平板，酵母表达手册好像是1%/24h甲醇诱导，酵母表达存在翻译后修饰，有可能会影响活性。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-09-26 00:39:43
10楼2016-09-26 08:38:37