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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因扩增
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liling0601

铜虫 (小有名气)

[求助] 基因扩增 已有2人参与

近期做一个1000bp的小片段扩增，结果非目的条带比目的条带亮很多，挑5个单菌落测序回来，5个都一样，和引物比对发现测序结果的引物倒数第二个碱基由A变成了T，请问这是引物设计问题还是退火温度设计的不合适？如何调整
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1楼 2016-09-12 14:23:44
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010308Jing

木虫 (正式写手)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-13 08:11:05
没太明白你的意思

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2楼2016-09-12 16:29:01
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werq63

金虫 (著名写手)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-13 08:11:11
可能是引物合成的问题

发自小木虫Android客户端
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3楼2016-09-12 20:55:56
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yuy111

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-13 08:11:16
It is not accurate in the primer annealing, and the PCR system is error prong.  You can use your system to do mutagenesis now. I am not kidding.
But if you do not need a mutagenesis PCR, so adjust all conditions of PCR including primer design to stricken the PCR.
You need to know the rules to design the PCR, besides, PCR buffer and concentration, anealing temperature, etc all must be optimized. Please let me know if you cannot make it work.
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4楼2016-09-13 00:14:11
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juzhixianwei

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-13 22:38:05
建议先查看一下测序图谱，看看那个位置是否可信。PCR的非特异性条带比较多，你可以尝试提高退火温度试试看。
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5楼2016-09-13 12:39:07
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79377

新虫 (初入文坛)
建议查看测序峰图再判断是不是突变

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6楼2016-09-13 20:42:07
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