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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 要扩增1KB的目的片断，PCR反应条件最好是什么呢？
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文又雨

铁虫 (初入文坛)

[交流] 要扩增1KB的目的片断，PCR反应条件最好是什么呢？

我要扩增的目的片断是1KB，我现在PCR用的反应条件是94度5min,94度1min,50度1min,72度2min,35个循环 ，再72度7min,可是现在都P不出目的条带来，是我的反应条件有问题吗？反应条件最好是怎么样的呢？谢谢各位大侠了。

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-3 at 15:26 ]
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1楼 2008-11-19 16:04:49
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xuedan0721

铜虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-15 11:05
个人建议,变性时间短点,45s, 94 5 min , 94 45s, 50 45s, 72 1min.
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2楼2008-11-19 16:52:27
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
首先确认模板、引物没问题
再不行就是酶的问题
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3楼2008-11-19 18:47:07
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whh1984

金虫 (小有名气)
有些时候做不出来也是很正常的，我也经常遇到做不出的时候
适当调整一下你的实验参数试试吧。不止是pcr反应条件，可以调整一下反应体系试试
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4楼2008-11-19 21:45:35
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yuyixst

木虫 (正式写手)
楼上说的是，试着调节下退火温度
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5楼2008-11-20 15:36:18
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lanmayi229

新虫 (小有名气)
★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 8-15 11:05
现象：正对照有条带，而样品则无
原因:
1.模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer对样品不合适
3.引物设计不当或者发生降解
4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策:
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更换Buffer或调整浓度
3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4.降低退火温度、延长延伸时间
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一阴一阳为之道，一女一子为之好
6楼2008-11-20 15:52:09
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yhxiang

金虫 (小有名气)
在确认你的模板没有问题的情况下做梯度PCR找出合适的退火温度，如果梯度pcr都没有目的条带的话就是你用的酶和buffer有问题了
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向往从容淡定的生活
7楼2008-11-20 16:07:12
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zhengxiu

金虫 (小有名气)

p不出来原因很多哦

时间什么的没有什么很大的关系，先看看你的DNA是不是好的，再看看你的反应体系，还有你的退火温度都会有影响，以及你个人技术都是有关系的
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8楼2008-11-20 18:33:33
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shmimy

铜虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-15 11:06
不同的酶也使得结果不一样
这是我花了好久的时间才知道的
你可以根据以上朋友说的调整一下体系，
最后再换一下酶试一下，因为不同的酶效果不一样
你可以用rTaq酶，ExTaq酶，LA酶做一下
或许会有不同的结果。
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9楼2008-11-20 21:43:23
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figo.339

木虫 (著名写手)
个人建议,94 5 min , 94 30s, 50 45s, 72 1min,72 10min
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10楼2008-11-20 22:32:47
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