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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 要扩增1KB的目的片断，PCR反应条件最好是什么呢？
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文又雨

铁虫 (初入文坛)

[交流] 要扩增1KB的目的片断，PCR反应条件最好是什么呢？

我要扩增的目的片断是1KB，我现在PCR用的反应条件是94度5min,94度1min,50度1min,72度2min,35个循环 ，再72度7min,可是现在都P不出目的条带来，是我的反应条件有问题吗？反应条件最好是怎么样的呢？谢谢各位大侠了。

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-3 at 15:26 ]
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1楼 2008-11-19 16:04:49
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lanmayi229

新虫 (小有名气)
★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 8-15 11:05
现象：正对照有条带，而样品则无
原因:
1.模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer对样品不合适
3.引物设计不当或者发生降解
4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策:
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更换Buffer或调整浓度
3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4.降低退火温度、延长延伸时间
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一阴一阳为之道，一女一子为之好
6楼2008-11-20 15:52:09
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xuedan0721

铜虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-15 11:05
个人建议,变性时间短点,45s, 94 5 min , 94 45s, 50 45s, 72 1min.
赞一下(6人) 回复此楼
2楼2008-11-19 16:52:27
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
首先确认模板、引物没问题
再不行就是酶的问题
赞一下 回复此楼
3楼2008-11-19 18:47:07
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whh1984

金虫 (小有名气)
有些时候做不出来也是很正常的，我也经常遇到做不出的时候
适当调整一下你的实验参数试试吧。不止是pcr反应条件，可以调整一下反应体系试试
赞一下 回复此楼
4楼2008-11-19 21:45:35
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