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文又雨

铁虫 (初入文坛)

[交流] 要扩增1KB的目的片断,PCR反应条件最好是什么呢?

我要扩增的目的片断是1KB,我现在PCR用的反应条件是94度5min,94度1min,50度1min,72度2min,35个循环 ,再72度7min,可是现在都P不出目的条带来,是我的反应条件有问题吗?反应条件最好是怎么样的呢?谢谢各位大侠了。

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-3 at 15:26 ]
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xuedan0721

铜虫 (小有名气)


司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-15 11:05
个人建议,变性时间短点,45s, 94 5 min , 94 45s, 50 45s, 72 1min.
2楼2008-11-19 16:52:27
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

首先确认模板、引物没问题
再不行就是酶的问题
3楼2008-11-19 18:47:07
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whh1984

金虫 (小有名气)

有些时候做不出来也是很正常的,我也经常遇到做不出的时候
适当调整一下你的实验参数试试吧。不止是pcr反应条件,可以调整一下反应体系试试
4楼2008-11-19 21:45:35
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yuyixst

木虫 (正式写手)

楼上说的是,试着调节下退火温度
5楼2008-11-20 15:36:18
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lanmayi229

新虫 (小有名气)

★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 8-15 11:05
现象:正对照有条带,而样品则无
原因:
1.模板:含有抑制物,含量低
2.Buffer对样品不合适
3.引物设计不当或者发生降解
4.反应条件:退火温度太高,延伸时间太短
对策:
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更换Buffer或调整浓度
3.重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物
4.降低退火温度、延长延伸时间
一阴一阳为之道,一女一子为之好
6楼2008-11-20 15:52:09
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yhxiang

金虫 (小有名气)

在确认你的模板没有问题的情况下做梯度PCR找出合适的退火温度,如果梯度pcr都没有目的条带的话就是你用的酶和buffer有问题了
向往从容淡定的生活
7楼2008-11-20 16:07:12
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zhengxiu

金虫 (小有名气)

p不出来原因很多哦

时间什么的没有什么很大的关系,先看看你的DNA是不是好的,再看看你的反应体系,还有你的退火温度都会有影响,以及你个人技术都是有关系的
8楼2008-11-20 18:33:33
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shmimy

铜虫 (小有名气)


司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-15 11:06
不同的酶也使得结果不一样
这是我花了好久的时间才知道的
你可以根据以上朋友说的调整一下体系,
最后再换一下酶试一下,因为不同的酶效果不一样
你可以用rTaq酶,ExTaq酶,LA酶做一下
或许会有不同的结果。
9楼2008-11-20 21:43:23
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figo.339

木虫 (著名写手)

个人建议,94 5 min , 94 30s, 50 45s, 72 1min,72 10min
10楼2008-11-20 22:32:47
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