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银虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 182
帖子: 19
在线: 15.4小时
虫号: 2340034
注册: 2013-03-12
专业: 化学生物学与生物有机化学

[求助] 连接、转化后不长菌，求支招

载体骨架是通过pcr扩增得到的，然后进行双酶切（hind III 和kpnI）,酶切回收后约50ng/ul（长是3800bp）
目标片段是在T载体上，也进行双酶切（hind III 和kpnI），切胶回收是160ng/ul(长是2300bp)

用的是fermentas的T4连接酶，22℃连接1h
连接体系如下：
载体骨架    2ul
插入片段    1ul
水          14.5ul
T4 buffer    2
T4酶          0.5ul
-----------------------------
total             20ul
做转化后一个菌液没有长，做了四次了，载体和插入片段连接比例试过1:3,1:5,1:7，都没有菌落长出，求大神支招，还是我可能哪方面除了问题