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lzhwin

木虫 (正式写手)

[交流] 求助：western转膜的问题

这两天在做western，连续转了3次膜立春红S染色，结果什么都没有，太让人伤心了。
具体细节：
    植物叶片总蛋白提取，目的蛋白约70KD  浓缩胶5% 分离胶8%。上样跑两块胶其中一块做了考马斯亮蓝染色有明显条带。
    PVDF膜先用甲醇处理约5秒，然后放入转膜缓冲液（甘氨酸、Tris、甲醇）中浸泡，叠放顺序均润湿过，黑板、海绵、两张滤纸、凝胶、膜、PVDF膜、两张滤纸、海绵、白板。biorad湿转，插入是黑板对应黑板，200mA恒流1小时，取出立春红S染色5分钟，整个膜变成红色，什么条带都没有。
PVDF膜是不是有反正面啊？感觉一面亲水一面疏水啊。
肯定是关键步骤出了问题，否则不可能一点条带都没有。大家帮帮忙吧！
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1楼 2008-11-18 21:40:33
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prettymuch

★ ★
lzhwin(金币+2,VIP+0):谢谢
PVDF膜用甲醇多处理一下把，我一般要处理5min，一般来说NC膜有转过的问题，PVDF膜好像还不会出现这种问题，应该没有正反面的
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2楼2008-11-21 15:20:09
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lzhwin

木虫 (正式写手)
昨天用NC膜试了一次居然转出来了，这下更晕了。PVDF膜应该更好啊？为什么会转不出来？看别人用PVDF膜也不过是在含甲醇的转膜缓冲液里泡了一下而已。
再问个问题：凝胶、膜、滤纸的大小关系应该怎样？我知道如果滤纸太大连在一起会短路，如果是膜比凝胶小、滤纸比膜小结果使得凝胶直接接触了正极海绵这样是不是也算短路呢？
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3楼2008-11-23 11:11:36
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
lzhwin(金币+2,VIP+0):谢谢
那些东西对于溶液来说不等于是透明的吗，不存在短路的问题
可能是你的PVDF膜处理不好或者质量太差
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4楼2008-11-23 11:40:12
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lzhwin(金币+1,VIP+0):谢谢！ 9-29 20:45
你试试用预染marker再转一次，不行的话PVDF膜不要用了
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5楼2008-11-23 11:40:31
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lzhwin

木虫 (正式写手)
终于用立春红染出来了
昨天重新转了一次膜，立春红染仍然什么都没有，绝望之下把膜重新扔在纯甲醇里泡了一分钟，蒸馏水洗膜，再染居然出来了，条带还很清晰。大家也是这么做的吗？如果我不用立春红染，封闭之前需不需要用甲醇处理？
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6楼2008-11-24 14:05:46
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