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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌落PCR验证，好悬乎
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qingchul

新虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR验证，好悬乎 已有2人参与

想请教一下各位，最近在做一个基因片段测序，1400bp左右，具体片段未知，我用taq酶退火温度59度扩增出特异片段之后，回收，连接到质粒载体PGR107上面（T4连接酶的体系）转到大肠杆菌DH5a里面去，之后用PCR扩增时候的引物去菌落PCR验证，退火温度还是59度，扩出来的条带有很多杂带，不知道为什么？求教啊，很着急
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1楼 2016-08-18 11:20:59
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-18 21:49:56
可能引物的特异性不好。菌P的时候退火温度可以提高几度试试。
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2楼2016-08-18 14:11:52
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雨儿天0320

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-18 21:50:21
你的菌落 PCR的酶是哪种？一般的普通r taqj就行，越是高保真酶杂带反而多，我的实验结果就是这样的，后来就一直用普通酶做菌落PCR.
希望对你有帮助
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3楼2016-08-18 14:35:48
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唠叨的河

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-18 21:50:48
一般情况下不会选择用菌落PCR做鉴定，扩增模板是菌液的话，一是不容易扩增，二是容易出现假阳性.(PS:工作量确实会变少一点）。为什么不选择酶切来鉴定重组质粒呢？
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4楼2016-08-18 14:51:55
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qingchul

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 唠叨的河 at 2016-08-18 14:51:55
一般情况下不会选择用菌落PCR做鉴定，扩增模板是菌液的话，一是不容易扩增，二是容易出现假阳性.(PS:工作量确实会变少一点）。为什么不选择酶切来鉴定重组质粒呢？

我没有听过，想听你具体说说
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5楼2016-08-18 16:19:43
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qingchul

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 雨儿天0320 at 2016-08-18 14:35:48
你的菌落 PCR的酶是哪种？一般的普通r taqj就行，越是高保真酶杂带反而多，我的实验结果就是这样的，后来就一直用普通酶做菌落PCR.
希望对你有帮助

普通的taq酶，菌落PCR我之前做一直没有问题，今年做就是没有结果，很着急
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6楼2016-08-18 16:21:48
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唠叨的河

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by qingchul at 2016-08-18 16:19:43
我没有听过，想听你具体说说...

你可以把单克隆菌挑出来，提质粒，然后用选择合适的酶切方案进行酶切呀。如你的载体是酶切处理的吧，就可以用处理载体的酶对挑取的单克隆质粒进行酶切鉴定呀（假设你的片段上没有改酶切位点，并且你可以用生物软件分析酶切位点挑选其它合适的酶切位点），如果酶切鉴定正确，应该90%多都证明连接正确，最后再测序鉴定。
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7楼2016-08-19 09:14:06
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)
如果用的是宝生物的T载体，应该是有酶切位点的，可以提个质粒，酶切看一下

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8楼2016-08-19 09:30:21
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werq63

金虫 (著名写手)
看看有没有合适的酶切位点，质粒提取出来做酶切

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9楼2016-08-19 14:24:18
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