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qingchul

新虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR验证,好悬乎 已有2人参与

想请教一下各位,最近在做一个基因片段测序,1400bp左右,具体片段未知,我用taq酶退火温度59度扩增出特异片段之后,回收,连接到质粒载体PGR107上面(T4连接酶的体系)转到大肠杆菌DH5a里面去,之后用PCR扩增时候的引物去菌落PCR验证,退火温度还是59度,扩出来的条带有很多杂带,不知道为什么?求教啊,很着急
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werq63

金虫 (著名写手)

看看有没有合适的酶切位点,质粒提取出来做酶切

发自小木虫Android客户端
9楼2016-08-19 14:24:18
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-18 21:49:56
可能引物的特异性不好。菌P的时候退火温度可以提高几度试试。
2楼2016-08-18 14:11:52
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雨儿天0320

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-18 21:50:21
你的菌落 PCR的酶是哪种?一般的普通r taqj就行,越是高保真酶杂带反而多,我的实验结果就是这样的,后来就一直用普通酶做菌落PCR.
希望对你有帮助
3楼2016-08-18 14:35:48
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唠叨的河

新虫 (初入文坛)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-18 21:50:48
一般情况下不会选择用菌落PCR做鉴定,扩增模板是菌液的话,一是不容易扩增,二是容易出现假阳性.(PS:工作量确实会变少一点)。为什么不选择酶切来鉴定重组质粒呢?
4楼2016-08-18 14:51:55
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