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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 小白咨询质粒构建相关问题
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苦逼岁月

新虫 (正式写手)

[求助] 小白咨询质粒构建相关问题 已有3人参与

大家好，我是新手对于构建质粒！
第一个问题是如何看质粒上的MCS（多克隆位点），是质粒图谱上标准的所有酶切位点上都是MCS，还是只是粗黑色箭头表示的区域是MCS？
第二个问题就是我实际中的碰到的问题，本实验室只有pET-32a这个表达载体，然而我老师想用pET-SUMO这个质粒，所以我们就自己构建；我们首先问别人要到了SUMO基因的模版，然后分别用带有酶切位点的引物把SUMO基因扩出来酶切（Ndel+Bamh1）;然后用Ndel+Bamh1酶切质粒pET-32a;然后连接转化，现在总是做不出来，问题就是这样做有问题么？嗯，我也问了群里的一些人，他们说你这样做应该做不出来，他们说我用Ndel这个酶切位点第一不再MCS上，第二他有两个酶切位置，你这样酶切会把质粒切碎，破坏质粒的完整性，肯定扩不出来！所以我想请问大家一下！！！！！
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1楼 2016-08-16 09:27:35
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 苦逼岁月 at 2016-08-16 16:31:37
唉，要是老师愿意我就买了！我前后做了两个星期。。。...

就当练手吧，那两个酶切位点没破坏复制起始位点和抗性基因，构建出来没问题，按照要求做出来没问题。两个星期而已，有些问题要靠自己去解决的，如果你想别人帮你解决，你得说详细些，不然没办法帮手，何况你最大的帮手是你实验室的老板和同事，
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做基因修饰的老菜鸡
9楼2016-08-17 09:08:39
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普通回帖

korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-16 22:06:00
如果载体上有两个ndel内切酶位点的话，建议不要使用，这个变数太多。
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2楼2016-08-16 09:49:47
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ken19860823

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+6, 鼓励热心回帖交流 2016-08-16 22:06:26
第一个问题：MSC肯定是多克隆位点，一般是成簇在质粒载体上，多克隆位点的酶切位点在载体上一般是唯一的，当然你用之前一定要用序列软件如VECTORNTI或者snapgene去看看。载体一般很精简的，很少多余片段，要了解载体结果，特别表达载体有严格限制的，你不在多克隆位点克隆，其他位置克隆进去也表达不了啊。
第二个问题：你自己都把问题分析出来了啊，但是我还是不清楚你是在哪一步卡住的，首先你要扩增出你的sumo基因（我想你的意思应该是CDS，基因几百kb都有，相信你们实验室扩增不出来，扩增4000以上就很难了）。测序这一步过了没，因为如果sumo里面带有你的ndeI或者BamHI,那么也是做不出来的，而且后面别人也给你了解释，因为载体带有NdeI位点，克隆酶切位点选择不是那么麻烦，选择目的载体多克隆位点的酶切位点，并且目的片段不含有的就行，当然避免同尾酶也得考虑。单酶切就注意要载体去磷酸化就行，没那么难。
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做基因修饰的老菜鸡
3楼2016-08-16 14:25:12
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苦逼岁月

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by korchagin at 2016-08-16 09:49:47
如果载体上有两个ndel内切酶位点的话，建议不要使用，这个变数太多。

是有两个Ndel酶切位点，老师说把他们全部切掉 应该问题不大
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4楼2016-08-16 14:25:53
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苦逼岁月

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by korchagin at 2016-08-16 09:49:47
如果载体上有两个ndel内切酶位点的话，建议不要使用，这个变数太多。

嗯嗯，我们只是想把我们手上的pet-32a改造成pet-sumo质粒，这样可行么，不过目前来看做了好几次都是空载
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5楼2016-08-16 15:47:01
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苦逼岁月

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-08-16 14:25:12
第一个问题：MSC肯定是多克隆位点，一般是成簇在质粒载体上，多克隆位点的酶切位点在载体上一般是唯一的，当然你用之前一定要用序列软件如VECTORNTI或者snapgene去看看。载体一般很精简的，很少多余片段，要了解载体 ...

谢谢这么细致的回答，但是我们在利用pet-32a这个骨架上把Ndel+Bamh1之间切下，置换成我们的SUMO基因，都不行吗？我们在SUMO基因上有ATG启动子，也不行吗？不能表达吗
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6楼2016-08-16 15:52:34
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 苦逼岁月 at 2016-08-16 15:52:34
谢谢这么细致的回答，但是我们在利用pet-32a这个骨架上把Ndel+Bamh1之间切下，置换成我们的SUMO基因，都不行吗？我们在SUMO基因上有ATG启动子，也不行吗？不能表达吗...

NdeI在多克隆位点下游trx有两个酶切位点，BamHI在多克隆位点。你做这个改变没问题，做不出来就多做几次。建议直接花几百网上买吧，浪费精力，
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做基因修饰的老菜鸡
7楼2016-08-16 16:20:29
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苦逼岁月

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-08-16 16:20:29
NdeI在多克隆位点下游trx有两个酶切位点，BamHI在多克隆位点。你做这个改变没问题，做不出来就多做几次。建议直接花几百网上买吧，浪费精力，...

唉，要是老师愿意我就买了！我前后做了两个星期。。。
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8楼2016-08-16 16:31:37
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实验小白里的那只萌新啊。。。
之所以要选择MCS区的酶切位点，是因为MCS区的位点在整个载体骨架上都是唯一的，如果选择的酶切位点不在MCS区，可能直接把你的PET-32a切碎了，你这个载体就构建不成了，图谱上除了MCS区的酶切位点，有时候也会显示别的酶切位点，那些是用来改造载体，或者鉴定载体用到的，你可以直接忽略。
另外，Atg不是启动子，是起始密码子。 启动子应该是T7，
另外看了一下图谱，目测是能够做出来的，
测了几次都是空载体，那就是酶的问题哦，用Nde1 切完怎么都不会转出来空载体的。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
10楼2016-08-17 10:43:27
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