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小白咨询质粒构建相关问题 已有3人参与
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大家好，我是新手对于构建质粒！ 第一个问题是如何看质粒上的MCS（多克隆位点），是质粒图谱上标准的所有酶切位点上都是MCS，还是只是粗黑色箭头表示的区域是MCS？ 第二个问题就是我实际中的碰到的问题，本实验室只有pET-32a这个表达载体，然而我老师想用pET-SUMO这个质粒，所以我们就自己构建；我们首先问别人要到了SUMO基因的模版，然后分别用带有酶切位点的引物把SUMO基因扩出来酶切（Ndel+Bamh1）;然后用Ndel+Bamh1酶切质粒pET-32a;然后连接转化，现在总是做不出来，问题就是这样做有问题么？嗯，我也问了群里的一些人，他们说你这样做应该做不出来，他们说我用Ndel这个酶切位点第一不再MCS上，第二他有两个酶切位置，你这样酶切会把质粒切碎，破坏质粒的完整性，肯定扩不出来！所以我想请问大家一下！！！！！ |
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ken19860823
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9楼2016-08-17 09:08:39
korchagin
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2楼2016-08-16 09:49:47
ken19860823
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+6, 鼓励热心回帖交流 2016-08-16 22:06:26
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第一个问题：MSC肯定是多克隆位点，一般是成簇在质粒载体上，多克隆位点的酶切位点在载体上一般是唯一的，当然你用之前一定要用序列软件如VECTORNTI或者snapgene去看看。载体一般很精简的，很少多余片段，要了解载体结果，特别表达载体有严格限制的，你不在多克隆位点克隆，其他位置克隆进去也表达不了啊。 第二个问题：你自己都把问题分析出来了啊，但是我还是不清楚你是在哪一步卡住的，首先你要扩增出你的sumo基因（我想你的意思应该是CDS，基因几百kb都有，相信你们实验室扩增不出来，扩增4000以上就很难了）。测序这一步过了没，因为如果sumo里面带有你的ndeI或者BamHI,那么也是做不出来的，而且后面别人也给你了解释，因为载体带有NdeI位点，克隆酶切位点选择不是那么麻烦，选择目的载体多克隆位点的酶切位点，并且目的片段不含有的就行，当然避免同尾酶也得考虑。单酶切就注意要载体去磷酸化就行，没那么难。 |
3楼2016-08-16 14:25:12
4楼2016-08-16 14:25:53