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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 关于原核表达包涵体纯化复性的问题
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feixieliuli

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于原核表达包涵体纯化复性的问题已有2人参与

大肠杆菌表达的带His标签的蛋白，上清和包涵体均有。
    上清放置2天左右，目的蛋白沉淀很严重，若破菌之后马上纯化，在500mM咪唑洗脱时目的蛋白沉淀很严重，加入0.2%SLS，沉淀消失。
    包涵体是用4M尿素过夜溶解的，溶解的很充分，上镍柱纯化时，在100mM咪唑洗脱时严重沉淀（沉淀为目的蛋白），加0.2%SLS沉淀不溶解。500mM咪唑洗脱（洗脱下来目的蛋白浓度很高）时沉淀严重，加入0.2%SLS之后，加速沉淀，用不含咪唑的A液（4M尿素，20mM Tris，0.15M NaCl）稀释洗脱液，也会加速目的蛋白沉淀，但是用B液（4M尿素，20mM Tris，0.15M NaCl，500mM 咪唑）稀释沉淀消失。沉淀消失之后加0.2%SLS则不会引起沉淀。
    复性时，直接把500mM咪唑纯化样品（含4M尿素）透析到复性液（0M尿素），透析袋刚放入复性液，透析袋中马上出现沉淀，将蛋白离心之后继续复性，然后就不会沉淀，复性好之后的样品得率很低，但是Elisa结果很好。 复性前样品含有0.2%SLS效果较差。

求大神分析一下这种原因及解决办法。
PS:8M尿素溶解样品复性之后效果很差。
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不念过去，不畏将来
1楼2016-08-10 11:51:18
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feixieliuli

铜虫 (小有名气)
没人么？求解答呀！
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不念过去，不畏将来
2楼2016-08-10 13:42:52
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547star

木虫 (著名写手)
看资料，一般是按梯度浓度来透析吧。你可以试试4M尿素的样品，先透析到2M，然后0.5-1M，然后0.1M,然后0M。
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为什么
3楼2016-08-10 14:05:45
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feixieliuli

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2016-08-10 14:05:45
看资料，一般是按梯度浓度来透析吧。你可以试试4M尿素的样品，先透析到2M，然后0.5-1M，然后0.1M,然后0M。

这个样品溶解的时候都没问题，为什么纯化的时候沉淀严重，用含高浓度咪唑的样品稀释沉淀就会消失?我现在想的是我当初用4M尿素溶解这个包涵体是不是就是不稳定，我看很多资料都说是在4M蛋白质就开始复性了。
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不念过去，不畏将来
4楼2016-08-10 14:13:37
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feixieliuli

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2016-08-10 14:05:45
看资料，一般是按梯度浓度来透析吧。你可以试试4M尿素的样品，先透析到2M，然后0.5-1M，然后0.1M,然后0M。

还有就是我的蛋白预测等电点为10.15，我纯化和复性的缓冲液都是pH8.0，有没有可能是因为pH值不合适造成的？
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不念过去，不畏将来
5楼2016-08-10 14:17:00
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
feixieliuli: 金币+5, ★有帮助 2016-08-12 09:48:57
复性涉及蛋白质折叠，包含二硫键和其他次级键的打开和形成，除了变性剂浓度逐步降低，溶液中可以考虑采用各种不同的还原剂（谷胱甘肽氧化型和还原型各种比例），离子浓度（比如氯化钠），pH值，一般要避开等电点。不同的蛋白，复性条件有差别。自己找资料看，摸索看看了。
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为什么
6楼2016-08-10 14:53:50
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feixieliuli

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2016-08-10 14:53:50
复性涉及蛋白质折叠，包含二硫键和其他次级键的打开和形成，除了变性剂浓度逐步降低，溶液中可以考虑采用各种不同的还原剂（谷胱甘肽氧化型和还原型各种比例），离子浓度（比如氯化钠），pH值，一般要避开等电点。不 ...

这个包涵体很诡异，用含0.1%、1%的Triton都能把目的蛋白洗脱下了，但是8M尿素溶解包涵体跟Ni柱结合的就特别差，4M又结合的很好，但是不稳定，很崩溃。上清表达量也很高，但是放置就沉淀。
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不念过去，不畏将来
7楼2016-08-11 09:13:11
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514278815

木虫 (小有名气)
建议低温18度诱导过夜表达试试，并且iptg浓度低一些

发自小木虫Android客户端
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8楼2016-08-12 19:21:32
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feixieliuli

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 514278815 at 2016-08-12 19:21:32
建议低温18度诱导过夜表达试试，并且iptg浓度低一些

低温和降低IPTG浓度是为了让蛋白可溶表达么？
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不念过去，不畏将来
9楼2016-08-13 09:37:01
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renyanbin

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by feixieliuli at 2016-08-11 09:13:11
这个包涵体很诡异，用含0.1%、1%的Triton都能把目的蛋白洗脱下了，但是8M尿素溶解包涵体跟Ni柱结合的就特别差，4M又结合的很好，但是不稳定，很崩溃。上清表达量也很高，但是放置就沉淀。...

会不会实变形不充分？我们一般要8M尿素+2M盐酸胍变形2天，这样比较充分，之前也有遇到变性时间短，不挂柱或挂柱不洗脱的情况，增加变性时间就好了。
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10楼2018-01-08 12:54:42
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