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象牙白

银虫 (小有名气)

[求助] 8kb的质粒转化小提质粒后跑胶只有1.5kb条带最亮 已有5人参与

大家好,我是最近两个月开始做定点突变,目的质粒是8kb,经过几次做单点突变实验在amp平板上一共收集到32个单克隆都送去测序,全都没有信号。于是将测序的样品跑胶发现全是在1.5kb处有最亮的条带。后来慢慢排查这个1.5kb条带怎么产生的,同时将所有枪头等用到的器材全都灭菌一次,并且把转化前的原始质粒也跑一次胶,发现原始质粒里有1.5kb的条带,见图。目前的状况是,我单单对质粒进行转化(没有做点突变)然后小提质粒后跑胶最亮还是1.5kb,拿去测序完全不对。被蒙圈了,求大侠援助.

8kb的质粒转化小提质粒后跑胶只有1.5kb条带最亮
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小元,加油!
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象牙白

银虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 976592787 at 2016-08-10 22:18:54
原始质粒你转化了跑胶就这样的结果很正常,你去追究这个问题干嘛,搞笑,质粒是环状的dna分子,直接跑胶的话是没法用marker来对应分子量的,你要切了之后才行,而且切了之后最理想情况是全切开,就在8kb左右,如果没 ...

我转化完测序结果不对,当我想要扩增质粒的时候很尴尬。
小元,加油!
14楼2016-08-11 14:17:01
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象牙白

银虫 (小有名气)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖提问 2016-08-09 08:06:08
我上周末做了原始质粒的切胶纯化,在转化,发现结果还是一样的,1.5kb处仍然是很强的条带。
小元,加油!
2楼2016-08-08 23:10:50
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-09 08:06:20
(然后小提质粒后跑胶最亮还是1.5kb,拿去测序完全不对。)这什么质粒,测序结果发来看看。这种多次突变的话楼主应该选PUC的拷贝型质粒呀,构建完后在转目的质粒。实验要一步一步来的,贪多嚼不烂。
采菊东篱下,悠然见南山。
3楼2016-08-09 08:02:53
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闲来小译

金虫 (正式写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-09 08:06:30
原始质粒挺脏的,怎么得到的?如果是1.5kb,质粒也太小了,还会有抗性基因的表达?确定你用的抗生素是有效的。如果已知8kb上特定序列信息,可以用菌落PCR筛选正确的8kb质粒。
PS:胶图上的三号孔是什么鬼?
4楼2016-08-09 08:04:52
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