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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 酶切后的tag free蛋白挂在镍柱上
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孤の魔灵

银虫 (小有名气)

[求助] 酶切后的tag free蛋白挂在镍柱上 已有2人参与

目标蛋白大小5kDa，蛋白可溶性表达，融合Sumo Tag，纯化后用含有His Tag的Sumo蛋白酶酶切，标签被切开，之后用Ni-IDA回收。
条件：上样Buffer：50mM Tris，300mM NaCl，20mM 咪唑，pH8.0
洗脱：50mM 100mM 500mM 咪唑梯度洗脱
结果：流出中没有目标蛋白，50mM和100mM咪唑洗脱液中有目标蛋白，但是也同时存在Sumo Tag
求各位大神帮帮忙，怎样得到我的tag free蛋白
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1楼 2016-07-23 11:17:43
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
孤の魔灵: 金币+5, ★有帮助 2016-08-03 16:00:17
酶切后，用亲和的分不开，可以尝试其他的比如离子交换，凝胶过滤等。祝顺利
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2楼2016-07-25 11:25:35
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古月问你哦
发自小木虫Android客户端
3楼2016-07-25 14:55:28
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孤の魔灵

银虫 (小有名气)
.
4楼2016-07-25 16:16:41
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
孤の魔灵: 金币+10, ★有帮助 2016-08-03 16:00:31
你的实验本来是想让酶切后的目的蛋白从镍柱流穿吗？结果却是酶切后的目的蛋白和Ni-IDA有较强的吸附作用，导致无法和切下来的sumo分开吗？如果确定你酶切后的目的蛋白不带His，可以试试用Ni-NTA进行分离。NTA比IDA的吸附作用较弱，非特异性吸附要少些。
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读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
5楼2016-07-26 21:43:18
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孤の魔灵

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by keke226 at 2016-07-26 21:43:18
你的实验本来是想让酶切后的目的蛋白从镍柱流穿吗？结果却是酶切后的目的蛋白和Ni-IDA有较强的吸附作用，导致无法和切下来的sumo分开吗？如果确定你酶切后的目的蛋白不带His，可以试试用Ni-NTA进行分离。NTA比IDA的 ...

提高盐浓度会有效果么？我现在吧盐浓度提高到1.5M，非特异性吸附会不会少些
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6楼2016-07-27 09:44:54
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)
也可以试试看吧。理论上应该会有效果。

发自小木虫Android客户端
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读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
7楼2016-07-27 10:13:00
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孤の魔灵

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by keke226 at 2016-07-27 10:13:00
也可以试试看吧。理论上应该会有效果。

哎。。。失败了，蛋白还是挂柱了
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8楼2016-07-28 10:57:42
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 孤の魔灵 at 2016-07-28 10:57:42
哎。。。失败了，蛋白还是挂柱了...

那就换NTA试试吧。还是不行的话只能尝试离子交换或疏水了。

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读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
9楼2016-07-28 12:42:18
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孤の魔灵

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by keke226 at 2016-07-28 12:42:18
那就换NTA试试吧。还是不行的话只能尝试离子交换或疏水了。
...

没有NTA柱子。。。。。准备试试离子交换
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10楼2016-07-29 11:14:53
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