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孤の魔灵

银虫 (小有名气)

[求助] 酶切后的tag free蛋白挂在镍柱上 已有2人参与

目标蛋白大小5kDa,蛋白可溶性表达,融合Sumo Tag,纯化后用含有His Tag的Sumo蛋白酶酶切,标签被切开,之后用Ni-IDA回收。
条件:上样Buffer:50mM Tris,300mM NaCl,20mM 咪唑,pH8.0
洗脱:50mM 100mM 500mM 咪唑梯度洗脱
结果:流出中没有目标蛋白,50mM和100mM咪唑洗脱液中有目标蛋白,但是也同时存在Sumo Tag
求各位大神帮帮忙,怎样得到我的tag free蛋白
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 孤の魔灵 at 2016-07-28 10:57:42
哎。。。失败了,蛋白还是挂柱了...

那就换NTA试试吧。还是不行的话只能尝试离子交换或疏水了。

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读书廿年倦写字,如今翻书不识志,若知眷书悔前程,无如渔樵未识时。三年担柴熟山性,三年苦网谙水汹,前程在心自倦舒,识志何用书中清。
9楼2016-07-28 12:42:18
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查看全部 10 个回答

hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
孤の魔灵: 金币+5, 有帮助 2016-08-03 16:00:17
酶切后,用亲和的分不开,可以尝试其他的比如离子交换,凝胶过滤等。祝顺利
2楼2016-07-25 11:25:35
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3楼2016-07-25 14:55:28
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
孤の魔灵: 金币+10, 有帮助 2016-08-03 16:00:31
你的实验本来是想让酶切后的目的蛋白从镍柱流穿吗?结果却是酶切后的目的蛋白和Ni-IDA有较强的吸附作用,导致无法和切下来的sumo分开吗?如果确定你酶切后的目的蛋白不带His,可以试试用Ni-NTA进行分离。NTA比IDA的吸附作用较弱,非特异性吸附要少些。
读书廿年倦写字,如今翻书不识志,若知眷书悔前程,无如渔樵未识时。三年担柴熟山性,三年苦网谙水汹,前程在心自倦舒,识志何用书中清。
5楼2016-07-26 21:43:18
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