应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增
161/2返回列表12下一页
查看: 1568  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

LY1199

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增 已有3人参与

目的条带 400bp 左右
marker III  200  500  800  1200（最亮）  2000 3000 5000


体系
20ul   10uL 2*Taq Mix     2uL DNA  2ul引物  6ul DD Water


如下图所示
目的条带 不算亮  但是也出现了
下面那个200bp以下的很亮的带  是怎么回事？ 引物二聚体？


是因为引物浓度太大了吗？？？
另外marker说明书上说 最亮的带是1200bp   但是我图上确是200bp 最亮 ？？这是怎么回事？？？

PCR扩增
IMG_20160720_141052.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-07-20 14:45:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-07-25 18:28:01
引物二聚体这么亮。说明引物特异性不好。适当提高退火温度。
或者可以加大模版量，增加几个循环，这样目的片段的量会得到更多一些，方便后续实验

嗯  引物因为是在文献找的  没有自己搞
应该会有些问题  但是现在已经更换不了……55555
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2016-07-27 10:32:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-21 08:26:32
LY1199: 金币+2, ★有帮助 2016-07-29 10:41:48
看你扩增目的是什么？引物二聚体，如果不是做定量，有你的目标带就行，不用纠结。
赞一下 回复此楼
2楼2016-07-20 19:02:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huxiangyu

铁虫 (小有名气)
marker有问题，换吧。另外引物为0.1微升，改过来吧

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
分子生物学专业，希望和大家深入交流
3楼2016-07-21 03:31:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-20 19:02:57
看你扩增目的是什么？引物二聚体，如果不是做定量，有你的目标带就行，不用纠结。

我这个是扩增目的基因， 为后期做克隆做准备
我要做土壤微生物这个基因的定量PCR，做标准曲线需要用到搭载目的基因的质粒

不知道目前这种情况 可以用不
赞一下 回复此楼
4楼2016-07-24 23:08:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huxiangyu at 2016-07-21 03:31:59
marker有问题，换吧。另外引物为0.1微升，改过来吧

0.1ul？？   引物我稀释到2.5mM， 加的是2uL
0.1uL ？这么小？

marker我用的是索莱宝的marker III， 之后又换了新的
还是不行 200bp 的最亮
赞一下 回复此楼
5楼2016-07-24 23:11:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huxiangyu

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by LY1199 at 2016-07-24 23:11:51
0.1ul？？   引物我稀释到2.5mM， 加的是2uL
0.1uL ？这么小？

marker我用的是索莱宝的marker III， 之后又换了新的
还是不行 200bp 的最亮...

我们一般将引物稀释到10um，然后加入1ul。你算算吧，你这个引物加入太多了。另外marker联系换成塔克拉的，国内的做的太垃圾。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
分子生物学专业，希望和大家深入交流
6楼2016-07-25 02:11:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huxiangyu

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by LY1199 at 2016-07-24 23:11:51
0.1ul？？   引物我稀释到2.5mM， 加的是2uL
0.1uL ？这么小？

marker我用的是索莱宝的marker III， 之后又换了新的
还是不行 200bp 的最亮...

用2000marker即可

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
分子生物学专业，希望和大家深入交流
7楼2016-07-25 02:12:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
LY1199: 金币+5 2016-07-29 10:42:07
引用回帖:
4楼: Originally posted by LY1199 at 2016-07-24 23:08:13
我这个是扩增目的基因， 为后期做克隆做准备
我要做土壤微生物这个基因的定量PCR，做标准曲线需要用到搭载目的基因的质粒

不知道目前这种情况 可以用不...

为克隆做准备，可以用这对引物，扩出来胶回收目标条带就行。如果要做定量，建议重新设计引物。
赞一下 回复此楼
8楼2016-07-25 11:48:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-25 11:48:16
为克隆做准备，可以用这对引物，扩出来胶回收目标条带就行。如果要做定量，建议重新设计引物。...

好的  多谢指教
回复此楼
9楼2016-07-25 17:05:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by huxiangyu at 2016-07-25 02:11:00
我们一般将引物稀释到10um，然后加入1ul。你算算吧，你这个引物加入太多了。另外marker联系换成塔克拉的，国内的做的太垃圾。
...

OK 我再试试  多谢了
赞一下 回复此楼
10楼2016-07-25 17:09:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 LY1199 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 听说今天filecode变了 +17 布布和一二 2026-08-06 31/1550 2026-08-06 22:34 by qusibaya
[基金申请] filecode +10 等待解的谜 2026-08-06 14/700 2026-08-06 21:16 by zhanghaozhu
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +3 archvillain 2026-08-06 7/350 2026-08-06 21:05 by archvillain
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 6/300 2026-08-06 20:19 by 苏知砚
[基金申请] 基金中了 +4 laoda193707 2026-08-06 4/200 2026-08-06 18:56 by olivermiaoer
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 12/600 2026-08-06 15:11 by eddyin
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[教师之家] 咨询面上基金 +4 李长云 2026-07-31 7/350 2026-08-06 11:20 by 李长云
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +22 低垂的野花 2026-07-31 30/1500 2026-08-05 18:03 by 低垂的野花
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 4/200 2026-08-05 09:59 by lfy8008
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[论文投稿] 十年后又回来了，论文投稿求助 +3 哈哈114477 2026-08-01 3/150 2026-08-04 15:40 by tegsgjy20
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
[基金申请] 娱乐 +4 Tide man 2026-08-03 4/200 2026-08-04 11:51 by wgch518
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭