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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增
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LY1199

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增 已有3人参与

目的条带 400bp 左右
marker III  200  500  800  1200（最亮）  2000 3000 5000


体系
20ul   10uL 2*Taq Mix     2uL DNA  2ul引物  6ul DD Water


如下图所示
目的条带 不算亮  但是也出现了
下面那个200bp以下的很亮的带  是怎么回事？ 引物二聚体？


是因为引物浓度太大了吗？？？
另外marker说明书上说 最亮的带是1200bp   但是我图上确是200bp 最亮 ？？这是怎么回事？？？

PCR扩增
IMG_20160720_141052.jpg
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1楼 2016-07-20 14:45:02
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LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-07-25 18:28:01
引物二聚体这么亮。说明引物特异性不好。适当提高退火温度。
或者可以加大模版量，增加几个循环，这样目的片段的量会得到更多一些，方便后续实验

嗯  引物因为是在文献找的  没有自己搞
应该会有些问题  但是现在已经更换不了……55555
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14楼2016-07-27 10:32:52
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-21 08:26:32
LY1199: 金币+2, ★有帮助 2016-07-29 10:41:48
看你扩增目的是什么？引物二聚体，如果不是做定量，有你的目标带就行，不用纠结。
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2楼2016-07-20 19:02:57
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huxiangyu

铁虫 (小有名气)
marker有问题，换吧。另外引物为0.1微升，改过来吧

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分子生物学专业，希望和大家深入交流
3楼2016-07-21 03:31:59
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LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-20 19:02:57
看你扩增目的是什么？引物二聚体，如果不是做定量，有你的目标带就行，不用纠结。

我这个是扩增目的基因， 为后期做克隆做准备
我要做土壤微生物这个基因的定量PCR，做标准曲线需要用到搭载目的基因的质粒

不知道目前这种情况 可以用不
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4楼2016-07-24 23:08:13
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LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huxiangyu at 2016-07-21 03:31:59
marker有问题，换吧。另外引物为0.1微升，改过来吧

0.1ul？？   引物我稀释到2.5mM， 加的是2uL
0.1uL ？这么小？

marker我用的是索莱宝的marker III， 之后又换了新的
还是不行 200bp 的最亮
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5楼2016-07-24 23:11:51
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huxiangyu

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by LY1199 at 2016-07-24 23:11:51
0.1ul？？   引物我稀释到2.5mM， 加的是2uL
0.1uL ？这么小？

marker我用的是索莱宝的marker III， 之后又换了新的
还是不行 200bp 的最亮...

我们一般将引物稀释到10um，然后加入1ul。你算算吧，你这个引物加入太多了。另外marker联系换成塔克拉的，国内的做的太垃圾。

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6楼2016-07-25 02:11:00
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huxiangyu

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by LY1199 at 2016-07-24 23:11:51
0.1ul？？   引物我稀释到2.5mM， 加的是2uL
0.1uL ？这么小？

marker我用的是索莱宝的marker III， 之后又换了新的
还是不行 200bp 的最亮...

用2000marker即可

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7楼2016-07-25 02:12:04
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
LY1199: 金币+5 2016-07-29 10:42:07
引用回帖:
4楼: Originally posted by LY1199 at 2016-07-24 23:08:13
我这个是扩增目的基因， 为后期做克隆做准备
我要做土壤微生物这个基因的定量PCR，做标准曲线需要用到搭载目的基因的质粒

不知道目前这种情况 可以用不...

为克隆做准备，可以用这对引物，扩出来胶回收目标条带就行。如果要做定量，建议重新设计引物。
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8楼2016-07-25 11:48:16
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LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-25 11:48:16
为克隆做准备，可以用这对引物，扩出来胶回收目标条带就行。如果要做定量，建议重新设计引物。...

好的  多谢指教
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9楼2016-07-25 17:05:32
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LY1199

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by huxiangyu at 2016-07-25 02:11:00
我们一般将引物稀释到10um，然后加入1ul。你算算吧，你这个引物加入太多了。另外marker联系换成塔克拉的，国内的做的太垃圾。
...

OK 我再试试  多谢了
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10楼2016-07-25 17:09:34
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