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丫头的格格巫

新虫 (初入文坛)

[求助] 以切胶回收DNA为模版,再次pcr 已有3人参与

有以切胶回收DNA为模版,再次做pcr成功的朋友么,有没有什么要注意的?我做过几次以切胶回收为模板pcr,要么就是没有目的条带,要么就是完全拖带~求解救。

@biostar2009 @飞约疯人院 @youlinglyw @wizardfan 发自小木虫IOS客户端
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寻找1

新虫 (正式写手)

2楼2016-07-19 23:18:24
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丫头的格格巫

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 寻找1 at 2016-07-19 23:18:24
我做过呀,很成功呀

请问有没有什么需要注意的?比如退火温度~?等等

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3楼2016-07-19 23:24:30
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寻找1

新虫 (正式写手)

4楼2016-07-19 23:26:43
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丫头的格格巫

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 寻找1 at 2016-07-19 23:26:43
和之前一样

我觉得我现在目的条带很淡,请问二次pcr的模版加多少啊,30微升的体系~

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5楼2016-07-19 23:37:23
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

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你是不是模板浓度高了,切胶回收后要稀释才能用吧
想做个有趣的人,却在逗比的道路上越走越远~
6楼2016-07-20 12:49:24
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feierorange

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
二次PCR,如果条带很亮的话,一般切胶回收的产物都需要稀释一下,如果完全拖带,可以考虑换个TOUCHDOWN的程序试试啊
7楼2016-07-20 16:58:18
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MMCCBB

新虫 (著名写手)

你需要将胶回收后的条带测序看是不是对的,有可能你的回收产物不对,测序现在挺便宜的,结果出来也快。

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8楼2016-07-20 20:23:53
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huxiangyu

铁虫 (小有名气)

没切胶的做一下对比吧,你这个很可能是切胶之后带了杂质

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分子生物学专业,希望和大家深入交流
9楼2016-07-21 03:13:48
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半仙0356

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
胶回收的时候尽量切除无荧光的胶,洗涤时可以多洗涤一次,洗脱时少量多次原则,这样洗脱效率更高,做PCR之前去测一下回收DNA浓度和OD值,PCR这跟以前一样了,

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10楼2016-07-21 08:31:32
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