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lusandanooo

银虫 (小有名气)

[求助] 载体双酶切后,回收不到任何东西? 已有1人参与

载体切了3ug,大小3k。没有做胶回收,直接做的产物纯化,用过生工和天根的试剂盒,做了好几次了,结果没有得到任何东西,双酶切跑了电泳条带是对的。排除操作可能,因为我是跟PCR产物一起做的,PCR产物回收到了,回收率70%,但载体一点都没回收到。

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
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lusandanooo

银虫 (小有名气)

补充,切了10ug后,胶回收之后用紫外测不到含量,260/230很低,只有0.1。电泳能看到条带。

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2楼2016-08-31 16:07:17
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lusandanooo

银虫 (小有名气)

毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
3楼2016-08-31 16:24:53
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lusandanooo

银虫 (小有名气)

4楼2016-09-01 15:16:54
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wx1308897716

木虫 (小有名气)

神虫

【答案】应助回帖

多切一点,量太少了吧,还有一个就是试剂盒回收后,跑电泳可能看不见,你还是可以直接连着试试,我经常回收片段跑电泳看不到条带,但是能连上
5楼2016-09-02 09:13:38
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lusandanooo

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wx1308897716 at 2016-09-02 09:13:38
多切一点,量太少了吧,还有一个就是试剂盒回收后,跑电泳可能看不见,你还是可以直接连着试试,我经常回收片段跑电泳看不到条带,但是能连上

切了10ug,已经很多了。我是电泳能看见,但紫外检测不到,260/280的值总是1.3左右。如果不定量的话我不知道该加多少载体啊……

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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
6楼2016-09-02 10:47:04
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lusandanooo

银虫 (小有名气)

7楼2016-09-02 15:20:09
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千里两句

新虫 (小有名气)

有些质粒就是这么恶心,实在不行硬上得了,切完直接纯化回收后做连接,连接RT半小时就可以了,取个1ul做转化,祝好,实在不行把这段需要的用PCR的方法P出来,然后酶切回收,说不定就成了

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8楼2016-09-02 20:41:34
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千里两句

新虫 (小有名气)

也可以用同源重组的方法,设计一对引物用来P载体,这对都带上目的片段的一部分,然后接助assembly kit进行同源重组就行了

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9楼2016-09-02 20:46:46
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千里两句

新虫 (小有名气)

P目的片段的引物带上载体的部分

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10楼2016-09-02 20:47:52
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