应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：设计引物一对
71/1返回列表
查看: 422  |  回复: 6
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

nandaxq

铜虫 (小有名气)

[交流] 求助：设计引物一对

因要用Real-Time做组织表达，要求引物的特异性很强，甚至二聚体都没有最好，

而本人，设计的引物，验证比较差，特请大家帮帮忙，先谢谢了！

引物设计要求：

1.PCR产物：200-250 bp

2.退火温度：55

序列如下：

5’至3‘

ACCATCCAGTGGACCATCATCATTAACATTTTGGTGTGGTTGGGCAGCTTCCTTCTGAGCATCCCGGTCATGATATATGCTAAAGTCATCTCCAAAAAGAACATGAACATATGTATGATTAACCTGGATGGGCCTCAGGATATGTACTGGTACACACTCTACCAGTCCATGCTGGGTTTCATCGTCCCCCTCATTATAATAAGCACATTTTACACTCTCACTCTGTACCACGTGTTCCGCTCCATCCGGCGGGTCAAACGCAAGCAGTCAGTGTGGGCCAAGCGGGCCACTAAGACAGTTGTGATGGTGATCGCCCTGTTCTTGGTCTGCTGGTCTCCCTATCATGTCATCCAGG
TGATCAACCTCAGCATCTGCCTG
回复此楼

» 猜你喜欢
引诱若够，女人无所谓正派；筹码若高，男人无所谓忠诚；骑着白马的唐僧；带着翅膀的鸟人。
1楼2008-11-10 20:31:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifei-fei

金虫 (著名写手)

伊丽莎白
恩，是要做定量PCR的引物吗？我帮你设，先占住，等会儿把引物发上来！
赞一下 回复此楼
做有意义的事就是好好活着！
2楼2008-11-10 20:36:48
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nandaxq

铜虫 (小有名气)
恩，是的，做荧光定量用，由于上次自己设计的效果比较差，都被老板K了一顿，浪费他钱，还请多多帮忙，谢谢！
赞一下 回复此楼
引诱若够，女人无所谓正派；筹码若高，男人无所谓忠诚；骑着白马的唐僧；带着翅膀的鸟人。
3楼2008-11-10 20:40:46
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifei-fei

金虫 (著名写手)

伊丽莎白
★ ★ ★ ★ ★
nandaxq(金币+5,VIP+0):太感谢了！希望一举命中！
Sense       5>CAGTCCATGCTGGGTTTC>3    53     216bp
Anti-sense 5>CAGGCAGATGCTGAGGTT>3    59

Sense       5>TGGATGGGCCTCAGGATA>3     55    212bp
Anti-sense 5>GAACCAGCAGACCAAGAA>3      50

本人做了好多基因的real-time RT-PCR，引物的退火温度在52-60之间，均匀55度都能扩增，内参的退火温度正好也是55度！帮你设计了两条，一般出现一个峰值就可以用，你都合成吧，选择一个好点的！
赞一下(1人) 回复此楼
做有意义的事就是好好活着！
4楼2008-11-10 21:09:01
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nandaxq

铜虫 (小有名气)
真是太感谢你啦，马上下订单，呵呵，希望可以一步到位，我的内参基因也是55度，

THANKS！
赞一下 回复此楼
引诱若够，女人无所谓正派；筹码若高，男人无所谓忠诚；骑着白马的唐僧；带着翅膀的鸟人。
5楼2008-11-10 21:12:12
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hll8593

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

　　DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

　　2.引物长度一般在15~30碱基之间。

　　引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

　　3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

　　4.引物3′端要避开密码子的第3位。

　　如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

　　5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

　　引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

　　6.碱基要随机分布。

　　引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

　　7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

　　引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

　　两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

　　引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

　　8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

　　△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）

　　9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

　　引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

　　引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。

　　10.扩增产物的单链不能形成二级结构。

　　某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

　　11.引物应具有特异性。

　　引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

　　值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

　　做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

　　1)避免重复碱基，尤其是G.

　　2)Tm=58-60度。

　　3）GC=30-80%.

　　4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

　　5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

　　6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。

　　7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

　　要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

　　而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

　　至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。

　　做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

　　关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2009-09-05 15:51:19
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 nandaxq 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭